检测3型鸭甲肝病毒免疫组化方法建立和应用

发布时间：2017-08-10 05:21

  本文关键词：检测3型鸭甲肝病毒免疫组化方法建立和应用

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【摘要】：3型鸭甲肝病毒(DHAV-3)是严重危害雏鸭的病原,雏鸭感染可造成严重发病和死亡。本研究试图建立检测DHAV-3的免疫组化方法,对该病毒在感染雏鸭体内的分布进行定位检测,探索DHAV-3在感染雏鸭体内分布规律,为阐明DHAV-3的致病机理提供参考数据,为本病的诊断和甲醛保存样品的回顾性诊断提供可靠的实验室诊断方法。1.检测DHAV-3免疫组化方法的建立DHAV-3接种10日龄鸭胚,收集36h-72h死亡高峰期的且胚体病变情况明显的鸭胚尿囊液,用差速离心-氯仿抽提-超速离心获得初步纯化DHAV-3抗原,免疫家兔后获得兔抗DHAV-3高免血清,提取兔抗DHAV-3 IgG,建立和优化了检测DHAV-3免疫组化方法。该法能够特异性检测DHAV-3感染雏鸭组织(心脏、肝脏、脾脏等)的病毒抗原,而鸭瘟、鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌感染发病死亡雏鸭和健康雏鸭呈现阴性反应,具有良好的特异性。2.雏鸭不同途径人工感染DHAV-3病理模型的构建和免疫组化检测对300只无母源抗体1日龄雏鸭随机分成4组,1-3攻毒组90只／组,对照组30只,饲养至3日龄进行人工感染,攻毒组感染途径分别为口服、滴鼻、肌肉注射,剂量为0.4ml/只的DHAV-3感染死亡3日龄雏鸭肝脏匀浆,4组注射生理盐水为对照。攻毒组在人工感染后的1h、2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h、144h、 192h、240h、14d时间点随机剖杀6只,对照组剖杀2只,采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑、胰腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠、法氏囊、哈氏腺、胸腺、肌肉16个组织器官的样品,使用4%的多聚甲醛固定,记录各组雏鸭的发病死亡数量和死亡时间段,应用建立的免疫组化方法进行检测。人工感染后的24h～26h肌注组最先出现死亡,口服组和滴鼻组的雏鸭最初出现死亡时间相近,即人工感染后的36h-38h内。各组死亡高峰期均处于36h-72h,随着时间的推移,口服组、滴鼻组和肌注组雏鸭的死亡数量都在48h左右到达最高峰,随后呈现递减趋势,肌注组在96h内雏鸭死亡数量呈正态分布趋势。口服组、滴鼻组和肌注组的试验分别于攻毒后的144h、192h和120h结束,滴鼻组的死亡情况最为严重,其次是口服组,肌注组死亡最少,对照组未出现死亡情况。收集的感染DHAV-3死亡雏鸭心脏、肝脏、脾脏等16个组织器官均能检测出强烈的阳性信号,不同途径感染鸭体内的病毒分布情况则表明DHAV-3侵害雏鸭的主要靶器官为肝脏、脾脏、肾脏和肠道。随着感染时间的推移,靶器官阳性信号强度呈现逐渐增强的趋势,至72h左右达到最强。法氏囊、哈氏腺、胸腺为代表的免疫器官阳性信号的强度呈现强弱交替的情况,其余的非靶器官呈现中等或弱阳性。3.不同时间点DHAV-3病毒抗原在雏鸭组织内的定位和分布情况人工感染后1h、2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h、144h、192h三组雏鸭体内组织器官病毒分布情况如下：(1)口服组：十二指肠、空肠、回肠、直肠、法氏囊、哈氏腺、胸腺7个组织器官在攻毒后1h就检测出阳性信号,心脏、肝脏、脾脏、肾脏、盲肠5个组织器官在攻毒后4h检测出阳性信号,胰腺、肺脏在攻毒后6h有阳性信号呈现,肌肉在攻毒后24h检测出阳性信号,大脑在攻毒后36h组化结果呈现阳性。(2)肌注组：攻毒后1h十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠、法氏囊、哈氏腺、胸腺、肌肉10个组织器官中就能检测出3型鸭甲肝病毒,攻毒后2h肝脏、肾脏中也分布有病毒抗原,心脏、脾脏、肺脏在攻毒后4h检测出病毒抗原,胰腺在攻毒后12h检测出病毒抗原,大脑在攻毒后36h检测出病毒抗原。(3)滴鼻组：心脏、法氏囊在攻毒后2h组化结果呈现阳性,肌肉在攻毒后4h组化结果呈现阳性,其余组织均在攻毒后的1h就检测出阳性信号。综上：本研究建立的免疫组化检测DHAV-3的方法具有良好的特异性,可用于DHAV-3感染雏鸭组织的亚细胞定位、DHAV-3感染死亡雏鸭的诊断、甲醛保存样品的回顾性诊断。DHAV-3经口服、滴鼻、肌肉注射途径感染雏鸭均可导致发病后死亡,死亡高峰期均处于36h～72h,雏鸭经滴鼻感染死亡最为严重。DHAV-3在感染雏鸭体内的分布规律为阐明DHAV-3的致病机理提供了有用的科学数据。
【关键词】：3型鸭甲肝病毒 免疫组化方法 抗原定位 病毒分布
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.32
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-8
• 缩略词表8-11
• 一 引言11-16
• 1 鸭甲型肝炎病毒概述11-13
• 1.1 历史与分布11
• 1.2 分型11
• 1.3 致病力11-12
• 1.3.1 流行病学11-12
• 1.3.2 临床症状和病理变化12
• 1.4 DHAV-3简述12-13
• 2 鸭甲型肝炎病毒的检测方法和定位及分布研究进展13-14
• 2.1 鸭甲型肝炎病毒检测方法的研究进展13
• 2.2 鸭甲型肝炎病毒在体内定位和分布研究进展13-14
• 3 免疫组化技术概述14-15
• 4 本研究目的和意义15-16
• 二 试验研究16-49
• 1 试验材料16-19
• 1.1 试验毒株16
• 1.2 参考毒(菌)株16
• 1.3 试验动物16
• 1.4 试剂16-17
• 1.5 试验仪器17-18
• 1.6 其他18-19
• 2 方法19-23
• 2.1 兔抗DHAV-3高免血清的制备及其IgG提取和鉴定19-20
• 2.1.1 DHAV-3抗原制备19
• 2.1.2 兔抗DHAV-3血清的制备19
• 2.1.3 兔抗DHAV-3血清中IgG的提取19-20
• 2.1.4 IgG的鉴定20
• 2.2 检测雏鸭感染DHAV-3免疫组化方法的建立和优化20-22
• 2.2.1 间接免疫酶组织化学法的基本试验步骤20-21
• 2.2.2 优化方案筛选21
• 2.2.3 读片标准21-22
• 2.2.4 特异性试验22
• 2.3 DHAV-3不同途径人工感染雏鸭病理模型的构建22-23
• 2.4 DHAV-3感染雏鸭体内病毒定位和分布检测23
• 3 结果和分析23-44
• 3.1 兔抗DHAV-3抗体的制备和纯化23-25
• 3.1.1 DHAV-3的增殖和纯化23-24
• 3.1.2 兔抗DHAV-3抗体的制备与纯化24-25
• 3.2 检测雏鸭感染DHAV-3免疫组化方法的建立和优化25-34
• 3.2.1 间接免疫酶组化方法染色步骤25-26
• 3.2.2 特异性试验26-34
• 3.3 DHAV-3不同途径人工感染雏鸭病理模型的构建34-35
• 3.3.1 不同途径人工感染雏鸭的死亡情况35
• 3.4 免疫组化检测不同途径雏鸭感染DHAV-3体内抗原定位和分布35-44
• 3.4.1 免疫组化检测感染雏鸭组织染色结果35-41
• 3.4.2 不同途径感染雏鸭各组织免疫组化检测结果41-44
• 4 讨论44-49
• 4.1 病毒纯化及抗体制备44
• 4.2 检测雏鸭感染DHAV-3免疫组化方法的建立44-46
• 4.2.1 免疫组化方法的建立和优化44-45
• 4.2.2 免疫组化方法的优势45-46
• 4.2.3 免疫组化与检测DHAV其他方法的比较46
• 4.3 感染DHAV-3病毒分布规律和病毒致病性的关系46-48
• 4.3.1 不同途径DHAV-3在雏鸭体内分布规律的比较及其意义46-47
• 4.3.2 DHAV-3在组织器官的分布特点与病毒特性的关系47-48
• 4.4 雏鸭感染DHAV-3病毒分布和感染DHAV-1病毒分布的比较48-49
• 三 结论49-50
• 参考文献50-55
• 致谢55-56
• 附录56-58

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