水稻瘤矮病毒在介体电光叶蝉中经卵传播的研究

发布时间：2017-08-10 06:04

  本文关键词：水稻瘤矮病毒在介体电光叶蝉中经卵传播的研究

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【摘要】：近年来由水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus, RGDV)所引起的水稻瘤矮病在我国广东省稻区流行。RGDV属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus),主要由介体电光叶蝉(Recilia dorsalis)以持久增殖型方式传播。目前,国内外学者己对RGDV的发生、危害、病害症状、基因组结构与功能等做了大量的研究。然而关于RGDV在介体电光叶蝉中是否能经卵传播的问题还存在争议,有关RGDV在介体电光叶蝉卵巢内的侵染过程还未有相关报道。本研究利用分子检测技术即RT-PCR法,对RGDV是否能在其主要介体电光叶蝉中经卵传播进行了验证。为避免因带毒雌虫取食而感染产卵稻苗,挑取毒虫虫卵移至湿润滤纸上,孵化后立即转移至新的试管健康苗上单管单虫饲养至羽化。结果表明：带毒虫的Fl代和F2代平均带毒率分别为78.6%和80.0%,初步证明RGDV能够通过介体电光叶蝉经卵传播。为了进一步验证病毒如何侵入卵,本研究用卵壳处理试剂——季铵盐萃取剂(1%Hyamine)按照时间梯度处理虫卵,检测结果表明不同时间梯度处理组与水处理对照组的昆虫平均带毒率为75%左右。因此我们初步认为卵壳不参与RGDV的经卵传播,RGDV在排卵之前即携带病毒。此外,通过雌雄虫水盘交配试验发现带毒雌虫与无毒雄虫交配的后代带毒,而无毒雌虫与带毒雄虫交配的后代不带毒,表明后代的带毒情况只与雌虫是否带毒相关,而与雄虫无关。且无毒虫与带毒虫交配后不发生虫体间的水平传播,即RGDV在介体电光叶蝉中不能通过交配传播。为了明确RGDV侵染卵巢的过程,本研究通过免疫荧光标记技术系统地分析了电光叶蝉饲毒并羽化后不同天数RGDV在介体电光叶蝉生殖系统的分布情况。结果表明：雌性电光叶蝉羽化后第1-2天,RGDV首先会侵染卵巢端丝、卵管柄及输卵管部位；第3～4天RGDV出现在生殖区部位建立侵染点并大量增殖；第5-6天RGDV从生殖区侵染点扩散至整个生殖区；第7-8天、9-10天RGDV随着卵巢的发育向卵柄方向扩散,在生长区和卵黄形成区先后有RGDV的分布,至此整个卵巢管有大量RGDV的分布。该研究结果系统地阐述了RGDV在电光叶蝉卵巢的侵染过程,使我们对病毒在介体昆虫卵巢的侵染有了进一步的认识。RGDV属于持久增殖型病毒,其存在于介体电光叶蝉体内的各个组织中并且能够进行大量的复制增殖。已有研究结果认为RGDV编码的非结构蛋白Pnsll是形成病毒管状结构的组分,RGDV借助管状结构进行扩散。为此,本研究通过标记RGDV Pns11在电光叶蝉卵巢中的分布,以期进一步观察RGDV在卵巢中的扩散过程。共聚焦显微镜观察发现,RGDV在卵巢生殖区的滤泡细胞大量增殖后利用Pns11管状结构扩散到内部的卵母细胞；同时,RGDV在生殖区增殖后直接沿着不断发育延伸的滤泡细胞向卵柄方向扩散；到达卵黄原形成区时,RGDV利用Pns11管状结构沿着滤泡细胞与卵黄膜之间的营养运输通道——微绒毛结构扩散到卵内,最终侵染后代。而通过透射电子显微镜观察卵巢切片,也证明了上述结论。综上所述,本论文通过分子检测技术明确了RGDV能够通过介体电光叶蝉经卵传播,并通过免疫荧光标记技术和透射电镜技术直观地阐明了RGDV在电光叶蝉卵巢内的侵染过程,初步鉴定了RGDV编码的管状结构蛋白Pns11参与RGDV在电光叶蝉卵巢内的扩散,促进了对水稻病毒在介体昆虫卵巢内的侵染机理的进一步认识,为进一步阐明病毒在介体昆虫经卵传播的机制提供了依据,也为开拓新的病害防治途径奠定了基础。
【关键词】：水稻瘤矮病毒 电光叶蝉 经卵传播 免疫荧光 透射电子显微镜
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S432.41
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 1 引言11-23
• 1.1 水稻瘤矮病毒的研究现状11-15
• 1.1.1 水稻瘤矮病的发生和流行11
• 1.1.2 RGDV的病害特征11-12
• 1.1.3 RGDV的寄主与传播介体12-14
• 1.1.4 RGDV的病原性质和基因组结构14-15
• 1.2 介体昆虫传播植物病毒机制的研究进展15-19
• 1.2.1 非持久传播型以及半持久传播型植物病毒的传毒机理16
• 1.2.2 持久传播型植物病毒的虫传机理16-19
• 1.2.2.1. 持久非增殖病毒介体传毒机理研究18
• 1.2.2.2. 持久增殖型病毒介体传毒机理研究18-19
• 1.3 免疫荧光技术19-20
• 1.4 病毒经卵传播的研究进展20-21
• 1.5 本研究的目的和意义21-23
• 2 材料与方法23-31
• 2.1 材料、试剂与实验仪器23-24
• 2.1.1 材料来源23
• 2.1.2 主要试剂23
• 2.1.3 主要仪器及设备23-24
• 2.2 实验方法24-31
• 2.2.1 饲毒24
• 2.2.2 RT-PCR技术检测RGDV24-26
• 2.2.2.1 引物设计24
• 2.2.2.2 提取RGDV侵染的电光叶蝉总RNA24-25
• 2.2.2.3 RGDV P8的cDNA的合成25
• 2.2.2.4 PCR扩增RGDV P8基因25-26
• 2.2.2.5 琼脂糖凝胶电泳检测26
• 2.2.3 RGDV在介体电光叶蝉中垂直传播的验证26-28
• 2.2.3.1 RGDV在介体电光叶蝉后代带毒率的检测26-27
• 2.2.3.2 卵壳携带病毒经卵传播的验证27
• 2.2.3.3 交配传毒对后代昆虫带毒率的影响27-28
• 2.2.4 电光叶蝉的解剖28-29
• 2.2.5 免疫荧光标记29
• 2.2.6 透射电子显微镜常规(温)包埋、切片、染色及观察29-31
• 3 实验结果与分析31-47
• 3.1 电光叶蝉的带毒率检测31-32
• 3.2 RGDV在介体电光叶蝉中垂直传播的验证32-33
• 3.2.1 电光叶蝉后代带毒率的检测32
• 3.2.2 卵壳携带病毒经卵传播的验证32-33
• 3.2.3 交配传毒及对后代昆虫带毒率的影响33
• 3.3 利用免疫荧光技术研究RGDV在电光叶蝉卵巢的侵染过程33-44
• 3.3.1 电光叶蝉雌性生殖系统的形态学观察33-35
• 3.3.2 RGDV在电光叶蝉卵巢的侵染过程35-39
• 3.3.3 RGDV编码的管状结构蛋白Pns11在卵巢中的标记39-42
• 3.3.4 RGDV与Pns11管状结构的共定位观察42-44
• 3.4 透射电子显微镜观察RGDV在电光叶蝉卵巢的侵染过程44-46
• 3.5 小结46-47
• 4 讨论47-51
• 4.1 关于卵壳携带病毒经卵传播的讨论47
• 4.2 关于经交配传毒和精子传毒的可能性分析47-48
• 4.3 关于入卵机制的讨论48-49
• 4.4 本研究的特色和创新之处49
• 4.5 值得继续研究方向49-51
• 参考文献51-59
• 附录59-60
• 致谢60

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