苎麻性别分化相关基因的克

发布时间：2017-08-17 10:08

  本文关键词：苎麻性别分化相关基因的克隆、表达及遗传转化研究

  更多相关文章： 苎麻 ACC氧化酶 ACC合成酶 表达 转化

【摘要】：苎麻(Boehmeria nivea (L.) Gaud)是一种重要的多年生韧皮纤维作物,而苎麻开花不利于其营养生长,特别是三麻期会大量开花结实,从而使纤维品质和产量严重下降。另外,苎麻是雌雄同株,异花授粉作物,杂种优势利用潜力较大。但是由于苎麻品种高度杂合,F1代分离严重,需要在杂种优势利用中隔离和去雄,费时费力。因此生产中利用无花,或单一性别的苎麻具有重要意义。有研究发现,苎麻花发育和性别分化与乙烯密切相关,因此,研究苎麻性别分化相关基因,并对乙烯合成关键酶基因进行克隆、表达特征分析和遗传转化,对进一步了解苎麻性别决定分子机制和改良苎麻品种具有重要意义。本研究以苎麻GBN-08、GBN-09为材料,克隆了2个ACO基因和1个ACS基因的全长cDNA序列,进行了生物信息学分析,组织表达特异性分析,构建了过表达载体,获得了转BnACO1拟南芥植物。具体主要研究成果如下：1、苎麻BnACO1, BnACO2, BnACS2基因的cDNA序列全长分别为1476 bp,1377bp,1680bp。开放阅读框分别为981 bp,957bp,1503bp。编码氨基酸分别为326个,318个,500个。经Blast比对,BnACO.1基因与无花果等物种的ACO基因核苷酸序列相似性在79%以上,氨基酸序列的相似性在78%以上。苎麻BnAC02基因与桑白皮等物种ACO基因核苷酸序列相似性在82%以上,氨基酸序列相似性在84%以上。BnACS2基因与杂交种玫瑰等物种的ACS基因核苷酸序列的相似性在70%以上,氨基酸序列的相似性分别为65%以上。保守结构域分析,BnACO1基因和BnACO2基因属于20G-Fe Ⅱ_Oxy superfamily。BnACS2基因属于以磷酸吡哆醛(PLP)为辅酶的天门冬氨酸转氨酶家族(AA_Ⅰ superfamily)。2、实时荧光定量PCR分析表明苎麻BnACO1在苎麻根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达,其中,在雄花中表达最高,在根、茎中表达最低,且该基因受ABA、干旱和NaCl胁迫诱导表达。该基因可能在苎麻性别分化中起到一定作用并且在调控苎麻生长发育和应对环境胁迫时具有独特的表达模式。BnACO1、 BnAC02、BnACS2三个基因在GBN-08、GBN-09的雌花发育初期均有表达,特别在雌花花芽长度为2.0cm左右时表达差异性显著。3、成功构建了原核表达载体pQE-BnAC02,在37℃C条件下,1.0mmol/LIPTG诱导PQE-BnAC02表达出目的蛋白,诱导蛋白分子量大小约为36.15 kDa,与预测的蛋白大小一致。成功构建了过表达载体pRI 101-BnACO2,农杆菌介导转化拟南芥初步获得阳性转基因植株,并收获转基因拟南芥种子。
【关键词】：苎麻 ACC氧化酶 ACC合成酶 表达 转化
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S563.1
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 第1章 前言10-15
• 1.1 内源乙烯对植物性别表达的研究进展10-11
• 1.2 乙烯的生物合成11-14
• 1.2.1 ACC合成酶基因的克隆与功能研究进展11-12
• 1.2.2 ACC合成酶基因的表达调控12-13
• 1.2.3 ACC氧化酶基因克隆的研究进展13
• 1.2.4 ACC氧化酶基因的表达调控13-14
• 1.3 本研究的目的和意义14-15
• 第2章 苎麻ACO和ACS家族部分基因的克隆和序列分析15-34
• 2.1 试验材料、试剂与仪器15
• 2.2 方法15-23
• 2.2.1 苎麻组织总RNA的提取15-16
• 2.2.2 首链cDNA的合成16-19
• 2.2.3 RACE引物设计19-20
• 2.2.4 PCR扩增及目的基因片段的纯化回收20-22
• 2.2.5 PCR产物的TA克隆22
• 2.2.6 连接产物转化大肠杆菌Trans1-T122
• 2.2.7 PCR筛选阳性克隆22-23
• 2.2.8 cDNA开放读码框序列扩增23
• 2.2.9 克隆基因的生物信息学分析23
• 2.3 结果与分析23-32
• 2.3.1 BnACO1、BnACO2、BnACS2全长基因的克隆23-25
• 2.3.2 BnACO1、BnACO2、BnACS2基因的生物信息学分析25-32
• 2.4 讨论32-34
• 第3章 苎麻ACO1,ACO2,ACS2基因的表达特征分析34-44
• 3.1 试验材料、试剂与仪器34
• 3.2 方法34-36
• 3.2.1 苎麻各组织总RNA的提取34-35
• 3.2.2 实时荧光定量PCR引物设计35
• 3.2.3 gDNA去除和第一链cDNA的合成35-36
• 3.2.4 实时荧光定量PCR36
• 3.3 结果与分析36-41
• 3.3.1 RNA提取36-37
• 3.3.2 BnACO1基因不同部位表达差异性及胁迫诱导表达分析37-39
• 3.3.3 BnACO1、BnACO2、BnACS2基因的时空表达分析39-41
• 3.4 讨论与分析41-44
• 第4章 BnACO2基因原核表达、过表达载体构建以及及转化拟南芥研究44-56
• 4.1 试验材料、试剂与仪器44
• 4.2 方法44-51
• 4.2.1 原核表达载体构建44-48
• 4.2.2 植物转基因过表达载体的构建48-49
• 4.2.3 重组质粒转化农杆菌49-50
• 4.2.4 转化拟南芥50
• 4.2.5 转基因拟南芥的筛选和PCR鉴定50-51
• 4.3 结果与分析51-54
• 4.3.1 BnACO2基因原核表达载体的构建与重组质粒的酶切验证51-52
• 4.3.2 BnACO2基因过表达载体的构建与重组质粒的酶切验证52-53
• 4.3.3 转基因拟南芥的获得53-54
• 4.3.4 转基因拟南芥的PCR鉴定54
• 4.4 讨论54-56
• 第5章 结论与展望56-58
• 5.1 论文结论56
• 5.2 后续研究56-58
• 参考文献58-63
• 致谢63-64
• 作者简介64

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