表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与免疫原性分析

发布时间：2017-08-21 11:39

  本文关键词：表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与免疫原性分析

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【摘要】：水泡性口炎(Vesicular stomatitis,VS)是由水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV))引起的高度接触性人畜共患的重大传染性疫病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定通报传染病,也是《中华人民共和国进出境动植物检疫法》规定的进境动物二类传染病。目前,该病还没有有效的治疗方法,只能通过疫苗进行防控。在疫苗研究方面,国内外已有一些研究,但新型疫苗的研究有待进一步开发。VSV糖蛋白(G)定位在包膜的突起上,刺激机体产生中和抗体,呈现型乃至株的特异性,是研究VSV基因工程疫苗的首选抗原。本研究利用人5型复制缺陷型腺病毒为表达载体,构建了表达VSV单一血清型的G蛋白及两血清型G蛋白融合蛋白的重组腺病毒,并对其免疫原性进行了初步分析。本研究设计了三对分别扩增VSV-IN-G、VSV-NJ-G及VSV-IN-G-NJ-G基因的特异性引物,利用PCR技术扩增VSV-IN-G基因及VSV-NJ-G基因;通过GlyGlyGlyGlySer多肽序列的连接,利用融合PCR技术扩增VSV-IN-G-NJ-G基因。将三个目的基因分别克隆至腺病毒穿梭载体pacAd-CMV K-NpA中,构建含有目的基因的重组腺病毒穿梭质粒。利用PCR鉴定、双酶切鉴定及测序鉴定筛选阳性重组质粒。将鉴定正确的重组穿梭质粒分别用Pac I酶线性化后,与同样用Pac I酶线性化的骨架载体pacAd5 9.2-100共转染AAV-293细胞,成功包装出了三株重组腺病毒rAd-VSV-NJ-G,r Ad-VSV-IN-G及rAd-VSV-IN-G-NJ-G。将三种重组腺病毒分别接种于AAV-293细胞,连续传代至20代,测定其TCID50,效价均稳定。利用间接免疫荧光和western blot检测方法检测目的蛋白的表达,结果显示G蛋白在重组腺病毒中均可以正确表达,且具有良好的反应原性。为了评价三株重组腺病毒的免疫效果,本研究选取50只6~8周龄雌性BALB/c小鼠,随机分为5组,每组10只。将三株重组腺病毒分别以2周为间隔,肌肉注射及皮下注射接种小鼠3次。于首次接种后0,2,4,6周采集血液分离血清,利用间接ELISA检测VSV特异性抗体水平,结果显示均可诱导小鼠产生VSV特异性抗体。以病毒中和试验检测中和抗体水平,其中和抗体水平均在1:16~1:32之间。利用淋巴细胞增殖试验检测细胞免疫水平,结果表明均可以引起接种小鼠强烈的淋巴细胞增殖效应,且明显高于阴性对照组。以上结果表明,所构建的三株重组腺病毒可以很好地表达目的蛋白,接种小鼠可以引起一定的体液免疫和细胞免疫反应,为表达VSV糖蛋白重组腺病毒疫苗的深入研究奠定了基础。
【关键词】：水泡性口炎病毒 G蛋白 重组腺病毒 免疫原性分析
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 英文缩略表11-13
• 第一章 引言13-21
• 1.1 流行概况及危害13-14
• 1.2 病原及其理化性质14-15
• 1.3 病毒基因组结构及其结构蛋白15-17
• 1.4 VSV疫苗研究进展17-18
• 1.4.1 灭活苗17
• 1.4.2 弱毒苗17-18
• 1.4.3 亚单位疫苗18
• 1.4.4 基因工程疫苗18
• 1.5 重组腺病毒疫苗研究进展18-20
• 1.5.1 腺病毒18-19
• 1.5.2 复制缺陷型腺病毒载体19
• 1.5.3 腺病毒载体在疫苗研究中的应用19-20
• 1.6 本研究的目的和意义20-21
• 第二章 表达水泡性.炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定21-45
• 2.1 材料和方法21-26
• 2.1.1 菌株、细胞及质粒21
• 2.1.2 主要试剂21-23
• 2.1.3 主要的仪器设备23
• 2.1.4 实验所用主要试剂及配制方法23-26
• 2.2 实验方法26-37
• 2.2.1 引物设计26
• 2.2.2 Vero细胞的培养26-27
• 2.2.3 VSV-NJ的增殖27
• 2.2.4 VSV-NJ病毒RNA的提取27-28
• 2.2.5 VSV-NJ-G基因的RT-PCR扩增28
• 2.2.6 VSV-IN-G基因的扩增28-29
• 2.2.7 VSV-IN-G-NJ-G基因的扩增29-30
• 2.2.8 E.coli DH5α 感受态细胞的制备30
• 2.2.9 将目的基因克隆至T载体30-31
• 2.2.10重组腺病毒穿梭质粒的构建31-32
• 2.2.11大量提取重组穿梭质粒及骨架载体质粒32-33
• 2.2.12重组腺病毒的构建33-34
• 2.2.13重组腺病毒的鉴定34-36
• 2.2.14重组腺病毒的扩增及遗传稳定性分析36
• 2.2.15重组腺病毒G蛋白表达的鉴定36-37
• 2.3 实验结果与分析37-43
• 2.3.1 VSV-NJ-G基因的扩增37-38
• 2.3.2 VSV-IN-G基因的扩增38
• 2.3.3 VSV-IN-G-NJ-G基因的扩增38-39
• 2.3.4 重组腺病毒穿梭质粒的构建39
• 2.3.5 重组腺病毒的构建39-41
• 2.3.6 重组腺病毒的扩增与遗传稳定性分析41
• 2.3.7 Western blot检测G蛋白的表达41-42
• 2.3.8 间接免疫荧光检测42-43
• 2.4 讨论43-45
• 第三章 表达VSV G蛋白重组腺病毒对小鼠的免疫原性分析45-54
• 3.1 实验材料45
• 3.1.1 细胞及病毒45
• 3.1.2 试剂及实验动物45
• 3.1.3 主要仪器设备45
• 3.2 实验方法45-49
• 3.2.1 实验动物的选择和分组45-46
• 3.2.2 免疫原的制备46
• 3.2.3 动物免疫程序46
• 3.2.4 免疫后样品采集46-47
• 3.2.5 抗VSV特异性抗体的检测47
• 3.2.6 免疫小鼠中和抗体的检测47-48
• 3.2.7 免疫小鼠T淋巴细胞增殖试验48-49
• 3.3 结果49-52
• 3.3.1 抗VSV特异性抗体的检测49
• 3.3.2 免疫小鼠中和抗体的检测49-51
• 3.3.3 免疫小鼠淋巴细胞增殖试验51-52
• 3.4 讨论52-54
• 第四章 全文结论54-55
• 参考文献55-62
• 致谢62-63
• 作者简历63

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 管洁;邓瑶;陈红;杨扬;文波;谭文杰;;表达丙型肝炎病毒(HCV)截短型NS3与core融合抗原的重组腺病毒疫苗在小鼠中的免疫原性与保护效果分析[J];病毒学报;2015年01期

2 王先炜;李玉峰;姜平;;表达猪圆环病毒2型Cap和猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5融合蛋白重组腺病毒的构建和免疫原性测定[J];生物工程学报;2009年11期

3 杨玉艾;初晓辉;毕保良;杨亮宇;吴翱;邱春富;孙永科;;猪瘟病毒E0和E2蛋白融合表达的重组腺病毒构建及免疫保护性研究[J];中国预防兽医学报;2010年06期

4 韦显凯;侯继波;姜平;;表达猪流行性腹泻病毒S基因片段重组腺病毒的构建与免疫特性[J];中国兽医学报;2008年10期

5 李晓芳;张敏敏;葛金英;温志远;王喜军;陈伟业;步志高;;表达水疱性口炎病毒G基因重组新城疫病毒的构建及免疫原性研究[J];中国预防兽医学报;2014年04期

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本文编号：712693