山羊GSK-3β基因不同转录本的分离鉴定及表达模式研究

发布时间：2017-08-20 15:08

  本文关键词：山羊GSK-3β基因不同转录本的分离鉴定及表达模式研究

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【摘要】：糖原合成酶激酶-3(Glycogen Synthase Kinase-3)是一种通过自身磷酸化与去磷酸化对下游底物起到调控作用的丝/苏氨酸类蛋白激酶。GSK-3参与调控多种生物学信号通路,如包括Wnt、Hedgehog和IGF-1信号通路等,调控糖原合成、调节细胞分化增殖、细胞形态发育、细胞有丝分裂、肌肉和脂肪细胞增殖分化等多个方面有,在多个领域有重要的研究价值。在哺乳动物中,GSK-3基因有两个亚型GSK-3α和GSK-3β,随着研究深入,在人、小鼠和猪还发现存在GSK-3β基因的多个转录本形式。在家畜动物中对于GSK-3β基因的研究还比较少,并且关于山羊GSK-3β基因的不同转录本的研究还未见报道。本试验以我国第一个培育的肉羊品种南江黄羊为试验材料,利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR).分子克隆、实时荧光定量(qPCR)以及蛋白免疫印迹法(western blotting)等试验技术,成功克隆了山羊GSK-3β基因,并分离出山羊GSK-3β基因的多种转录本形式,并进一步从mRNA水平和蛋白水平对不同GSK-3β转录本在山羊不同组织中的表达情况进行研究,最后成功构建蛋白表达载体,具体结果如下：1.本次试验成功克隆得到山羊GSK-3β基因的编码区全序列,并且在山羊中发现了GSK-3β的六个不同转录本。山羊GSK-3β基因序列与绵羊、牛、猪等哺乳动物的具有很高的一致性,GSK-3β氨基酸序列在哺乳动物中上高度保守。山羊GSK-3β5转录本中存在外显子Exon 8b的插入,该基因序列在人,鼠和猪的研究中均有发现,且序列完全一致。本实验中首次报道了新的剪切转录形式GSK-3β2, GSK-3β4和GSK-3β6,在GSK-3β6中发现新的特异型外显子序列Exon 10b。基因序列提交至NCBI,登录号分别为KJ649149-KJ649154。2.利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测了山羊GSK-3β六个转录本基因在120日龄南江黄羊7个不同组织中的相对表达量。结果显示GSK-3β基因在山羊的心肌和大脑中有较高水平的表达(P0.01),在肝脏和肾脏中表达量相对较低。山羊GSK-3β不同转录本在脾脏、背最长肌和子宫中表达模式存在差异,且差异显著。3.使用蛋白免疫印迹方法检测山羊GSK-3β蛋白在7个不同组织中的表达情况。抗体特异性地识别了两个分子量大小有一定差异的蛋白条带。其中,在蛋白分子量为47kDa的位置,GSK-3β在心肌、大脑和背最长肌中表达水平较高,而在肝脏、脾脏和肾脏组织中的表达微弱；在蛋白分子量小于47kDa位置的条带中,心脏、脾脏、大脑、背最长肌和子宫组织中均可以检测到GSK-3β蛋白的表达,肾脏中表达量相对较低,肝脏中检测不到GSK-3β的蛋白表达。4.本研究成功构建了山羊GSK-3β六个转录本的表达载体。分别将山羊GSK-3β不同转录本有差异的基因序列连接到含有Flag蛋白标签的RT-Flag-31载体上,并通过酶切验证,分子克隆及菌液测序验证,证明载体构建的成功。该载体可用于下一步对羊GSK-3p不同转录本的蛋白表达及相关生物学功能的验证。
【关键词】：山羊 GSK-3β 转录本 组织表达 载体构建
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S827
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 符号说明9-13
• 1 文献综述13-21
• 1.1 GSK-3的基本概况13
• 1.2 GSK-3结构与调控13-14
• 1.3 GSK-3参与调控的重要信号通路研究14-16
• 1.4 GSK-3β对动物肌肉发育的调控作用研究16-18
• 1.5 GSK-3参与动物糖原代谢过程研究18-19
• 1.6 GSK-3不同亚型的功能研究进展19-20
• 1.7 本研究的目的与意义20-21
• 2 材料与方法21-37
• 2.1 试验材料组织样品21
• 2.2 主要仪器设备与试剂21-25
• 2.2.1 主要仪器21-22
• 2.2.2 主要试剂及相关配制22-25
• 2.3 试验方法25-37
• 2.3.1 实验样品的制备25
• 2.3.2 RNA的提取25-26
• 2.3.3 RNA的反转录(cDNA链反转录合成)26-27
• 2.3.4 山羊GSK-3β基因全序列的引物设计及合成27
• 2.3.5 RT-PCR扩增27-28
• 2.3.6 PCR产物胶回收28
• 2.3.7 目的基因的克隆28-29
• 2.3.8 生物信息学分析29-30
• 2.3.9 GSK-3β基因不同转录本的表达30
• 2.3.10 qPCR定量30-32
• 2.3.11 蛋白免疫印迹32-36
• 2.3.12 载体构建36-37
• 3 结果与分析37-50
• 3.1 山羊GSK-3β基因的克隆37-38
• 3.1.1 RNA质量检测37-38
• 3.1.2 PCR扩增检测结果38
• 3.2 山羊GSK-3β基因不同转录本的筛选38-39
• 3.3 菌液测序结果及核酸序列对比分析39-41
• 3.4 山羊GSK-3β基因不同转录本的RT-PCR验证41
• 3.5 氨基酸序列及蛋白结构预测分析41-45
• 3.5.1 氨基酸序列及蛋白预测结果41-43
• 3.5.2 蛋白功能域预测分析43-44
• 3.5.3 GSK-3β氨基酸序列的系统进化分析44-45
• 3.6 GSK-3β不同转录本mRNA水平的相对定量分析45-48
• 3.6.1 最适退火温度的选择及扩增标准曲线的绘制45-46
• 3.6.2 山羊GSK-3β基因不同转录本在各组织中的表达46-48
• 3.7 GSK-3β蛋白在山羊不同组织中的表达研究48-49
• 3.8 山羊GSK-3β不同真核转录本载体的构建49-50
• 4 讨论50-55
• 4.1 山羊GSK-3β基因不同转录本的分子克隆及生物信息学分析50-52
• 4.2 山羊GSK-3β不同转录本的蛋白功能域预测与蛋白免疫印迹结果分析52-53
• 4.3 山羊GSK-3β基因及蛋白的组织表达规律53-54
• 4.4 展望54-55
• 5 结论55-56
• 参考文献56-63
• 研究生期间论文发表情况63-65
• 致谢65

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本文编号：707303