一株抑制稻瘟菌的解淀粉芽孢杆菌的分离与次生代谢产物成分分析

发布时间：2017-08-27 21:20

  本文关键词：一株抑制稻瘟菌的解淀粉芽孢杆菌的分离与次生代谢产物成分分析

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【摘要】：稻瘟病是影响水稻产量最为严重的病害之一,目前以筛选具有抗性的水稻品种和化学防治手段相结合的方法来预防和治疗,随着人们生活水平的提高,稻瘟病的耐药性的增强以及抗性品种相关抗性的降低,利用天然产物或生物农药等防控手段的需求越来越大。1.本研究从抑菌试验中分离到的一株能够抑制稻瘟病生长的芽孢杆菌菌株。通过对其次生代谢产物进行分离和纯化,找到了数种具有生物活性的天然产物,并测定了其中一种活性物质的分子量。希望能够从其中筛选出具有良好生物活性,成本低廉的新次生代谢产物。2.试验中分离到5株对稻瘟病有抑制效果的菌株中,选择了效果最好的一株菌株进行研究,并暂命名为Rdx5。经形态学观察、淀粉水解酶观察和基于16SrDNA的系统进化树分析,确认该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefa ciens)。3.试验选用Landy液体培养基对Rdx5进行发酵培养,发酵液具有良好的抑制效果,说明活性成分存在于溶液中。同时,我们也做了抗生素敏感性试验,Rdx5表现出对多种抗生素敏感。4.Rdx5的次生代谢产物中,具有多种对稻瘟病有抑制作用的生物活性物质。液相萃取后在氯仿层、甲醇层、水层均有活性。氯仿／丙酮分配和高效液相色谱分析发现,仅在氯仿萃取层中至少含有三种生物活性物质。抑制稻瘟病的次生代谢产物具有良好的热稳定性和紫外线稳定性,酸碱稳定性较差。利用液相萃取、高效液相色谱技术,试验在数种具有抑菌活性的次生代谢产物中选择了一种进行了分离纯化,并最终得到了该生物活性物质,质谱分析表明,活性物质的分子量为586.2759。
【关键词】：解淀粉芽孢杆菌 稻瘟病 次生代谢产物 生物活性物质
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.111.41;S476.1
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 文献综述9-21
• 1 水稻概况9
• 2 稻瘟病概述9-19
• 2.1 稻瘟病的发生原因10-13
• 2.1.1 病原菌和孢子的存在10
• 2.1.2 水稻与稻瘟病病菌的互作10-11
• 2.1.3 病原菌的遗传多样性11-12
• 2.1.4 稻瘟病的变异12
• 2.1.5 适于稻瘟病发病的环境12-13
• 2.1.6 水稻抗稻瘟病品种与品系的差异13
• 2.2 稻瘟病的防治13-19
• 2.2.1 加强栽培管理13-14
• 2.2.2 筛选水稻抗性品种14
• 2.2.3 转基因抗性水稻的研究14-15
• 2.2.4 化学防治15-16
• 2.2.5 生物防治16-19
• 2.2.5.1 植物源农药17
• 2.2.5.2 真菌17-18
• 2.2.5.3 放线菌18
• 2.2.5.4 病毒18
• 2.2.5.5 细菌18-19
• 3 芽孢杆菌概述19-20
• 3.1 解淀粉芽孢杆菌概述19-20
• 3.2 解淀粉芽孢杆菌研究进展20
• 4 本研究的目的和意义20-21
• 第二章 稻瘟病菌拮抗菌的分离及鉴定21-45
• 1 引言21-22
• 2 材料与方法22-32
• 2.1 材料22
• 2.2 主要培养基22
• 2.3 主要试剂22-23
• 2.4 主要设备23
• 2.5 方法23-32
• 2.5.1 细菌的分离23
• 2.5.2 拮抗菌的筛选23-24
• 2.5.3 拮抗菌对稻瘟病菌的拮抗效果观察24
• 2.5.4 拮抗菌滤菌发酵液对稻瘟病菌的拮抗效果观察24
• 2.5.5 拮抗菌形态特征观察24-26
• 2.5.5.0 拮抗菌单菌落形态观察24
• 2.5.5.1 拮抗菌革兰氏染色鉴定24-25
• 2.5.5.2 拮抗菌扫描电子显微镜形态观察25
• 2.5.5.3 拮抗菌淀粉水解酶活性的观察25-26
• 2.5.6 拮抗菌滤菌发酵液抑制效果的测定26
• 2.5.7 拮抗菌发酵液抑制效果的测定26-27
• 2.5.8 拮抗菌分子生物学鉴定27-30
• 2.5.8.1 基因组DNA的获得27
• 2.5.8.2 感受态细胞的制作27-28
• 2.5.8.3 16SrDNA的获得28-29
• 2.5.8.4 系统进化树的构建29-30
• 2.5.9 抗生素敏感试验30-32
• 2.5.9.1 药敏纸片选用30-31
• 2.5.9.2 抗生素敏感试验步骤31
• 2.5.9.3 拮抗菌药物敏感性评估31-32
• 3 结果与分析32-45
• 3.1 拮抗菌筛选32-33
• 3.2 拮抗菌Rdx5滤菌发酵液抑制效果观察33
• 3.3 拮抗菌单菌落形态观察33-34
• 3.4 拮抗菌光学显微镜观察34-37
• 3.4.1 光学显微镜活菌观察34-35
• 3.4.2 光学显微镜革兰氏染色观察35-36
• 3.4.3 拮抗菌扫描电子显微镜观察36-37
• 3.5 淀粉水解酶活性观察37
• 3.6 拮抗菌Rdx5滤菌发酵液抑菌效果的测定37-39
• 3.7 拮抗菌Rdx5活菌抑制效果的测定39-40
• 3.8 拮抗菌Rdx5分子生物学鉴定40-44
• 3.8.1 总DNA的获得40
• 3.8.2 16SrDNA的获得40-41
• 3.8.3 16SrDNA测序结果41-43
• 3.8.4 拮抗菌Rdx5的16SrDNA鉴定结果43-44
• 3.9 拮抗菌Rdx5药物敏感性试验44-45
• 第三章 稻瘟病菌拮抗菌Rdx5次生代谢产物的分离及纯化45-54
• 1 材料与方法45-49
• 1.1 材料45
• 1.2 主要培养基45
• 1.3 主要试剂45
• 1.4 主要仪器45-46
• 1.5 方法46-49
• 1.5.1 次生代谢产物的稳定性46-47
• 1.5.1.1 次生代谢产物的热稳定性46
• 1.5.1.2 次生代谢产物的强酸碱稳定性46
• 1.5.1.3 次生代谢产物的紫外线照射稳定性46-47
• 1.5.2 次生代谢产物的极性鉴定47
• 1.5.3 氯仿层可溶次生代谢产物的氯仿提取干物质的丙酮溶解鉴定47-48
• 1.5.4 HPLC的分离及检测48
• 1.5.5 HPLC的分离物的收集48-49
• 1.5.6 HPLC的分离物的纯化49
• 2 结果与分析49-54
• 2.1 次生代谢产物的稳定性49-51
• 2.1.1 次生代谢产物的热稳定性49-50
• 2.1.2 次生代谢产物的强酸碱稳定性50
• 2.1.3 次生代谢产物的紫外线稳定性50-51
• 2.2 拮抗菌Rdx5次生代谢产物的极性鉴定51
• 2.3 氯仿层可溶次生代谢产物的氯仿提取干物质的丙酮溶解鉴定51
• 2.4 HPLC次生代谢产物的分离51-52
• 2.5 HPLC次生代谢产物的活性鉴定52-53
• 2.6 HPLC的分离物的纯化53-54
• 第四章 稻瘟病菌拮抗菌Rdx5次生代谢产物的鉴定54-57
• 1 引言54-55
• 2 材料与方法55-56
• 2.1 材料55
• 2.2 主要试剂55
• 2.3 主要仪器55
• 2.4 方法55-56
• 3 结果56-57
• 讨论57-60
• 展望及不足之处60-62
• 引用文献62-65
• 致谢65-66

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