菌丝霉素在毕赤酵母中的分泌表达及其对大鼠肠道健康和免疫功能的影响

发布时间：2017-08-30 08:13

  本文关键词：菌丝霉素在毕赤酵母中的分泌表达及其对大鼠肠道健康和免疫功能的影响

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【摘要】：饲料中添加抗生素可促进动物生长、提高饲料转化率、对某些疾病起预防和治疗作用,但抗生素的应用也带来了耐药性和残留等负面效应,因此其替代品的研发成为目前的研究热点。与传统抗生素相比,抗菌肽因其无耐药性且具有良好的抑菌效果而逐渐受到人们的关注。菌丝霉素(Ple)是2005年Mygind等人从腐生子囊菌分泌蛋白中筛选分离得到的首例真菌防御素,具有强烈的抗革兰氏阳性菌作用。但是由于从天然菌株中分离菌丝霉素工艺复杂,且成本较高,限制了其应用。为实现菌丝霉素的廉价生产,本研究成功构建了可分泌表达Ple的毕赤酵母基因工程菌,研究了重组表达产物的体外抑菌活性和稳定性；在此基础上初步评价其在动物试验中的应用效果。主要研究内容和结果如下：试验一：菌丝霉素多聚体基因在毕赤酵母中的表达为提高Ple基因的表达量,降低其表达产物对宿主的毒性,本研究室在前期研究中构建了Ple多聚体基因,并实现了在大肠杆菌中的表达。为进一步提高重组Ple表达水平,本试验将Ple多聚体基因克隆进入毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA,转化毕赤酵母X-33后得到一株基因工程菌PPle：在1%甲醇诱导下,其表达产物Ple能够有效分泌至培养基中,重组菌丝霉素分子大小约为41 kDa；在摇瓶中诱导,毕赤酵母基因工程菌PPle分泌水平达143μg/mL.该毕赤酵母工程菌的成功构建为进一步评估其抑菌效果奠定了基础。试验二：重组菌丝霉素分离纯化及体外抑菌活性研究为了初步探讨重组菌丝霉素的抑菌活性,将毕赤酵母基因工程菌PPle在摇瓶中诱导的表达产物通过His标签纯化,并进行体外抑菌试验。结果表明,本试验获得的重组菌丝霉素对猪链球菌和金黄葡萄球菌等革兰氏阳性菌有强烈的抑制作用；最小抑菌浓度显示菌丝霉素对猪链球菌最为敏感,最小抑菌浓度为4 μg/mL：重组菌丝霉素能从pH 2.0到10.0保持抗菌活性,且经胃蛋白酶消化处理后仍能保持较强的抑菌活性。上述研究结果表明,本实验室研发的重组菌丝霉素抗菌肽具有较强的稳定性,具有替代抗生素在动物生产上应用的潜力。试验三：重组菌丝霉素抗菌肽对大鼠肠道健康和免疫功能的影响为了考察重组Ple对大鼠肠道健康、免疫功能的影响,评估其在动物生产上的应用前景。本试验采用2×3因子设计,60只4周龄健康SD大鼠,按体重相近、雌雄各半的原则,随机分为6个处理(n=10),单笼饲养。大鼠分别通过腹腔连续注射重组Ple、万古霉素和培养上清液(对照)后。对其中一半大鼠进行金黄色葡萄球菌攻毒(另一半作为对照注射无菌生理盐水),所有大鼠继续饲养2周后宰杀取样。结果表明：金黄色葡萄球菌攻毒对大鼠免疫器官指数无显著影响,但大鼠血清IgA和IgM含量有降低的趋势(0.05P0.10),腹腔注射菌丝霉素和万古霉素均能提高大鼠血清免疫球蛋白含量,改善大鼠免疫机能；攻毒导致大鼠十二指肠绒毛高度下降、sIgA含量减少,盲肠金黄色葡萄球菌含量显著增加(P0.05),但注射菌丝霉素可缓解上述负面影响,其效果优于万古霉素。综上所述,本研究成功实现了Ple多聚体基因在毕赤酵母中的分泌表达；其表达产物(重组Ple)对革兰氏阳性菌特别是猪链球菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用；重组菌丝霉素可改善大鼠免疫功能和肠道健康,并在一定程度上替代万古霉素用于金黄色葡萄球菌感染的预防和治疗,有望成为一种潜在的抗生素替代品应用于动物生产。
【关键词】：菌丝霉素 多聚体 纯化 毕赤酵母 抑菌活性 大鼠 肠道健康 免疫功能
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S816
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 本文词语缩写9-14
• 引言14-15
• 第一部分 文献综述15-24
• 第一节 抗生素替代品研究现状15-17
• 1. 益生菌15
• 2. 酸化剂15-16
• 3. 酶制剂16
• 4. 抗菌肽16-17
• 5. 其它抗生素替代品17
• 第二节 菌丝霉素抗菌肽17-21
• 1. 菌丝霉素结构与功能的关系17-19
• 2. 菌丝霉素的生化性质19-20
• 3. 菌丝霉素的生物学活性20-21
• 第三节 菌丝霉素抑菌机理及其生产应用现状21-24
• 1. 菌丝霉素抑菌机理22-23
• 1.1 胞膜攻击作用22
• 1.2 细胞壁生成的抑制作用22
• 1.3 酶活抑制作用22-23
• 2. 菌丝霉素生产应用现状23-24
• 2.1 生产应用现状23
• 2.2 存在的问题23-24
• 第二部分 本研究的目的、内容、意义与技术路线24-26
• 1. 研究目的24
• 2. 研究内容24
• 3. 研究的意义24
• 4. 研究的技术路线24-26
• 第三部分 试验研究26-59
• 试验一 Ple多聚体基因在毕赤酵母中的表达26-41
• 1. 试验材料26-29
• 2. 试验方法29-35
• 2.1 重组质粒pMD19-T-Ple的抽提29
• 2.2 核酸电泳29
• 2.3 重组质粒pMD19-T-Ple的双酶切29-30
• 2.4 Ple多聚体基因酶切产物回收30
• 2.5 表达载体pPICZαA双酶切30
• 2.6 DNA连接反应30-31
• 2.7 大肠杆菌DH5α感受态制作与转化31
• 2.8 阳性转换子筛选31-32
• 2.9 表达载体pPICZαA-Ple大量制备32
• 2.10 表达载体pPICZαA-Ple线性化32
• 2.11 毕赤酵母X-33感受态制备32-33
• 2.12 毕赤酵母X-33电击转化33
• 2.13 酵母转化子培养和筛选33
• 2.14 酵母阳性转化子的诱导培养33-34
• 2.15 蛋白浓度测定34
• 2.16 SDS-PAGE检测34-35
• 3. 试验结果35-39
• 3.1 Ple多聚体基因的扩增35-36
• 3.2 毕赤酵母表达载体pPICZαA-Ple的构建36
• 3.3 毕赤酵母表达载体pPICZαA-Ple线性化36-37
• 3.4 电转化和阳性克隆子的筛选37-38
• 3.5 毕赤酵母基因工程菌PPle的诱导表达38-39
• 4. 讨论39-40
• 5. 小结40-41
• 试验二 重组菌丝霉素分离纯化及体外抑菌活性的研究41-48
• 1. 试验材料41
• 2. 试验方法41-43
• 2.1 基因工程菌PPle小规模诱导培养41-42
• 2.2 重组菌丝霉素的超滤浓缩42
• 2.3 重组菌丝霉素纯化42
• 2.4 SDS-PAGE检测42
• 2.5 重组菌丝霉素体外抑菌活性检测42
• 2.6 重组菌丝霉素的最小抑菌浓度42-43
• 2.7 重组菌丝霉素稳定性分析43
• 3. 试验结果43-46
• 3.1 重组菌丝霉素的纯化43-44
• 3.2 体外抑菌活性研究44-45
• 3.3 最小抑菌浓度45-46
• 3.4 pH和消化酶对重组菌丝霉素活性影响46
• 4. 讨论46-47
• 5. 小结47-48
• 试验三 重组菌丝霉素对大鼠肠道健康和免疫功能的影响48-59
• 1. 试验材料48
• 2. 试验方法48-52
• 2.1 重组菌丝霉素的制备与纯化48
• 2.2 试验设计和动物饲养管理48-49
• 2.3 样品采集49
• 2.4 考察指标及测定方法49-52
• 3. 数据统计和分析52
• 4. 试验结果52-57
• 4.1 重组菌丝霉素对大鼠免疫器官指数和血清免疫指标的影响52-53
• 4.2 菌丝霉素对大鼠肠黏膜形态和分泌型免疫球蛋白A的影响53
• 4.3 菌丝霉素对大鼠回肠、盲肠微生物菌群的影响53-57
• 5. 讨论57-58
• 6. 小结58-59
• 第四部分 全文结论、创新点与有待进一步研究的问题59-61
• 一、结论59
• 二、本文主要创新点59
• 三、有待进一步解决的问题59-61
• 参考文献61-70
• 致谢70-71
• 攻读硕士期间发表的文章71

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本文编号：758186