基因Ⅳ型HEVpORF3在L02细胞中的表达研究

发布时间：2017-08-30 03:27

  本文关键词：基因Ⅳ型HEVpORF3在L02细胞中的表达研究

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【摘要】：戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)是戊型肝炎(hepatitis E, HE)的病原体,可以引起主要由肠道传播的急性传染性戊肝。基因Ⅳ型HEV可以感染人和动物,其基因组结构与基因Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅲ型相差较大。HEV包括3个开放读码框(open reading frame, ORF),其中ORF3编码的小分子蛋白与细胞信号调控密切相关。HEV感染已经成为一个全球性的公共卫生问题,在亚洲和非洲的发病情况尤为严重。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP)共有26种,可以促进肿瘤细胞突破组织屏障作用进而侵袭周围组织。组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP)是MMP的天然抑制物,在人体内有4种。关于HEV ORF3对L02细胞MMP相关蛋白表达影响的分子机制的研究,可以为HEV与肝癌发生可能存在的关系的阐释奠定一定的研究基础。 本研究中的实验一通过PCR从pET42a-ORF3中克隆出基因Ⅳ型HEV ORF3基因,构建了pEGFP-ORF3和pEGFP慢病毒载体；并运用慢病毒包装试剂盒将上述慢病毒载体在293T细胞内包装成病毒颗粒；后将病毒颗粒感染L02细胞,筛选单克隆细胞,使得pEGFP-ORF3和pEGFP在L02细胞中可以稳定表达；运用流式细胞术和Western blotting进行鉴定。实验二运用蛋白(?)片技术对比分析了稳定表达pEGFP-ORF3和稳定表达pEGFP的的L02细胞的MMP表达谱,筛选出表达水平上调／下调的基质金属蛋白酶。结果表明,在稳定表达pEGFP-ORF3的L02细胞中,TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4表达水平均降低。研究结果为戊型肝炎病毒pORF3对L02细胞MMP相关蛋白表达影响的分子机制的研究提供了理论依据。
【关键词】：戊型肝炎 L02细胞 慢病毒转染 蛋白芯片 基质金属蛋白酶
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-8
• 第一章 文献综述8-22
• 1 HEV分子病毒学8-11
• 2 HEV流行病学11-13
• 2.1 HEV传染源11-12
• 2.2 HEV传播途径12-13
• 2.3 HEV易感人群13
• 3 HE临床表现及诊断13-18
• 3.1 HE临床症状13-14
• 3.2 HE特殊类型14-16
• 3.3 HE病理变化16
• 3.4 HE的诊断16-18
• 4 HE治疗及预防18-21
• 5 HE研究现状和展望21-22
• 第二章 稳定表达SHEV ORF3基因的L02细胞系的建立22-40
• 1 实验材料22-25
• 1.2 细胞和菌种22
• 1.3 主要试剂和载体22-23
• 1.4 主要仪器23
• 1.5 主要溶液配制方法23-25
• 2 实验方法25-34
• 2.1 稳定细胞系的建立25-31
• 2.1.1 L02细胞的培养25-27
• 2.1.2 慢病毒载体的构建27-29
• 2.1.3 慢病毒包装29-30
• 2.1.4 慢病毒液滴度测定30
• 2.1.5 慢病毒感染L02细胞30-31
• 2.1.6 稳定细胞系的筛选31
• 2.2 稳定细胞系的鉴定31-34
• 2.2.1 流式细胞术鉴定31
• 2.2.2 考马斯亮蓝染色鉴定31-33
• 2.2.3 Western blotting鉴定33-34
• 3 实验结果34-38
• 3.1 稳定细胞系的建立34-36
• 3.1.1 慢病毒包装34
• 3.1.2 慢病毒浓缩液滴度测定34-35
• 3.1.3 慢病毒感染效率35-36
• 3.2 稳定细胞系的鉴定36-38
• 3.2.1 单克隆细胞的鉴定36-37
• 3.2.2 稳定细胞系的鉴定37-38
• 4 讨论38-40
• 第三章 SHEV ORF3对L02细胞基质金属蛋白酶(MMP)表达的影响40-47
• 1 实验材料40-41
• 1.2 细胞40
• 1.3 主要试剂和载体40
• 1.4 实验仪器40-41
• 1.5 主要溶液配制方法41
• 2 实验方法41-43
• 2.1 收取蛋白样品41-42
• 2.2 Western blotting实验42
• 2.3 蛋白芯片分析42-43
• 3 实验结果43-45
• 3.1 Western blotting实验结果43
• 3.2 蛋白芯片分析结果43-45
• 4 讨论45-47
• 第四章 结论47-48
• 参考文献48-56
• 致谢56

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1 郭莳雨;基因Ⅳ型HEVpORF3在L02细胞中的表达研究[D];海南大学;2015年

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本文编号：757021