3株禽2型副黏病毒的分离鉴定与生物学特性初步分析

发布时间：2017-09-02 04:18

  本文关键词：3株禽2型副黏病毒的分离鉴定与生物学特性初步分析

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【摘要】：副黏病毒是在人和动物中广泛存在的一类病毒,其中的一些成员可以引起人和动物的严重发病,造成严重的公共卫生事件及重大的经济损失。2013年,在黑龙江省开展的野鸟中禽流感病毒的监测中,我们在大兴安岭及绥棱两个地区的野鸟样品中发现了3个有血凝活性,却不含禽流感和新城疫病毒的样品,为鉴定这些样品中可能存在的病原,我们开展了以下实验:首先,收集3个样品尿囊液及利用差速离心法处理后,分别取出100μL制备电子显微镜负染色样品并在电镜下观察。在这3个样品中均观察到副黏病毒样粒子:直径为150~200 nm,有囊膜且可见线性核酸。随后,分别提取了这些样品的核酸,利用随机引物对其进行扩增并测序,分析结果显示3个样品均含与禽2型副黏病毒基因组片段有较高的相似性(71~92%)的基因片段,表明3个样品中所含的病毒粒子与禽2型副黏病毒存在同源性。为进一步鉴定这些病毒,我们将3个样品并分别与NDV和APMV-2多克隆抗体进行血凝抑制试验,结果表明NDV阳性血清对3个病毒有低的抑制活性(23)而APMV-2多克隆抗体对3个抗原物质有较高的血凝抑制活性(29)。通过以上实验,我们初步鉴定这3株病毒为禽2型副黏病毒,并分别命名为APMV-2/Emberiza spodocephala/China/Daxing’anling/974/2013(APMV-2/Daxing’anling/974),APMV-2/Procarduelis nipalensis/China/Suiling/53/2013(APMV-2/Suiling/53),及APMV-2/Anthus ruf ulus/China/Suiling/106/2013(APMV-2/Suiling/106)。由于我国还没有有关野鸟中禽2型副黏病毒的报道,我们对这3株病毒的全基因组进行了测定。根据Gen Bank中下载的2型副黏病毒的基因组序列及随机扩增的结果,设计了对这3株病毒全基因组测序的引物,对其基因组序列进行了测定。测序结果表明3株病毒基因组序列全长均为15000 nt,按照5'-N-P-M-F-HN-L-3'顺序编码六个非重叠基因,基因组全长遵循“六拷贝原则”。这3株分离株的全基因组序列与其他禽2型副黏病毒的基因组序列相似性为75.8~80.2%,与APMV-2/Bangor相似性最高,基因3'端存在55 nt leader,5'端存在161 nt的trailer。3株病毒的P基因均存在m RNA编辑位点“A5G4”,通过m RNA编辑时在编辑位点G序列中插入1个G产生V蛋白或插入2个G从而产生W蛋白。三株病毒的N、P、M、F、L基因与其它6株2型副黏病毒(NK、F8、Yucaipa、England、Kenya、Bangor)的相应基因相似性最高的是Bangor,而HN基因相似性最高的是Kenya。将这3株病毒全基因组与本科中其它属代表毒株全基因组进行进化树分析显示此3株病毒与其它已知的6株病毒在进化上处于同一分支。为评估这3株病毒的致病性,我们选择APMV-2/Suiling/53进行了动物试验。经测定APMV-2/Suiling/53的鸡胚平均致死时间(MDT)为120 h,其脑内致病指数(ICPI)为零;SPF鸡和小鼠的感染试验表明,APMV-2/Suiling/53对SPF鸡呈低致病力而对BALB/c小鼠无致病性。本实验通过形态学观察、核酸分析与血凝抑制试验鉴定了3株禽2型副黏病毒,并对其全基因组和致病性进行了初步分析。研究结果为禽副黏病毒遗传多样性及致病性研究提供了基础资料。
【关键词】：禽2型副黏病毒 分离鉴定 基因组分析 致病性
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文缩略表12-13
• 第一章 引言13-18
• 1.1 副黏病毒简介13
• 1.2 禽副黏病毒粒子结构及其编码蛋白13-15
• 1.2.1 核衣壳蛋白14
• 1.2.2 磷酸化蛋白14
• 1.2.3 基质蛋白14
• 1.2.4 融合蛋白14-15
• 1.2.5 血凝素-神经氨酸酶15
• 1.2.6 聚合酶蛋白15
• 1.3 禽副黏病毒研究现状15-17
• 1.4 本研究的目的与意义17-18
• 第二章 禽2型副黏病毒的分离与鉴定18-23
• 2.1 材料与方法18-20
• 2.1.1 样品来源18
• 2.1.2 鸡胚18
• 2.1.3 实验中主要试剂18
• 2.1.4 病毒的分离18
• 2.1.5 电镜负染色检测18-19
• 2.1.6 随机扩增19
• 2.1.7 HI试验19-20
• 2.2 结果20-22
• 2.2.1 病毒的分离20
• 2.2.2 电镜观察20
• 2.2.3 核酸分析20-21
• 2.2.4 HI试验21-22
• 2.3 讨论22-23
• 第三章 分离病毒的全基因组测定及分析23-39
• 3.1 材料与方法23-26
• 3.1.1 主要试剂23
• 3.1.2 引物设计23-24
• 3.1.3 病毒RNA的提取24
• 3.1.4 全基因组序列测定24-25
• 3.1.4.1 中间部分序列测定24
• 3.1.4.2 两末端序列测定24-25
• 3.1.4.3 琼脂糖凝胶电泳25
• 3.1.5 序列拼接与分析25-26
• 3.2 结果26-38
• 3.2.1 全基因组拼接及分析26-31
• 3.2.2 N基因分析31
• 3.2.3 P基因分析31
• 3.2.4 M基因分析31
• 3.2.5 F基因分析31-32
• 3.2.6 HN基因分析32
• 3.2.7 L基因分析32-35
• 3.2.8 系统进化树的构建及分析35-38
• 3.2.8.1 F基因与HN基因进化树分析35-36
• 3.2.8.2 全基因组进化树分析36-38
• 3.3 讨论38-39
• 第四章 分离病毒致病性初步研究39-44
• 4.1 材料与方法39-40
• 4.1.1 实验材料与主要试剂39
• 4.1.2 病毒致病指数测定39
• 4.1.2.1 鸡胚平均致死时间39
• 4.1.2.2 脑内接种致病指数39
• 4.1.3 SPF鸡感染性试验39-40
• 4.1.4 BALB/c小鼠感染性试验40
• 4.1.5 组织和拭子中病毒分离检测40
• 4.2 结果40-42
• 4.2.1 鸡胚平均致死时间与脑内接种致死时间40
• 4.2.2 SPF鸡抗体水平检测40-41
• 4.2.3 SPF鸡组织中病毒分离检测41
• 4.2.4 SPF鸡气管组织病理变化41-42
• 4.2.5 BALB/c小鼠组织中病毒分离检测42
• 4.3 讨论42-44
• 第5章 全文结论44-45
• 参考文献45-49
• 致谢49-50
• 作者简历50

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本文编号：776341