梨‘中矮1号’矮生基因的筛选及PcAHS克隆与表达分析

发布时间：2017-09-05 16:28

  本文关键词：梨‘中矮1号’矮生基因的筛选及PcAHS克隆与表达分析

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【摘要】：‘中矮1号’是从‘锦香’梨实生后代中选出的优良梨矮化砧木。树体矮小紧凑,作砧木促进树体矮化,但其矮生和致矮机理尚不清楚。以‘中矮1号’及‘锦香’新梢嫩叶为试材,进行RNA-Seq分析,共获得2个品种46619个unigenes,其中长度大于1000 bp占23.25%,约71%的unigenes至少具有1条注释。使用IDE6软件对基因进行表达分析,控制FDR低于0.05,并且基因的最高表达量达到最低表达量的1.5倍时,该基因为差异表达基因。‘中矮1号’和‘锦香’中存在很多个差异表达的基因,有些可以作为矮化相关的候选基因,包括1个编码GA-3氧化酶基因,5个编码生长素相关蛋白基因,4个编码细胞色素P450蛋白基因,1个编码类LRR受体丝氨酸/苏氨酸激酶基因;2个编码脱落酸合成酶基因,3个编码乙烯响应转录因子基因,6个编码水分相关蛋白基因,2个NAC类转录因子和4个WRKY类转录因子基因。从中选取10个差异表达基因进行qRT-PCR验证,结果表明qRT-PCR结果与RNA-Seq结果一致。在上述差异表达的基因中,有1个注释为生长素氢转运体的基因在‘中矮1号’中为低表达,可能限制生长素的极性运输而导致‘中矮1号’矮生。因此,根据转录组测序结果,设计特异性引物,分别在‘中矮1号’和‘锦香’中克隆到了该基因序列。其全长1 239 bp,在2个品种间没有序列差异,均编码412个氨基酸,其氨基酸序列与苹果(NM_001293843.1)、梅(xp_008242099.1)、毛果杨(xp_002306421.2)、草莓(xp_004287713.1)的生长素氢转运体基因氨基酸序列的相似性在67%~99%之间,将其命名为PcAHS。qRT-PCR分析发现,在新梢旺盛生长期,PcAHS基因在‘中矮1号’新梢韧皮部中的表达量均低于母本‘锦香’,推测二者启动子序列可能存在差异。分别克隆了‘中矮1号’及其母本‘锦香’PcAHS基因上游启动子序列片段,长度分别为828 bp和888 bp,二者相似性为89.1%。序列分析发现‘中矮1号’PcAHS基因启动子上有一段58 bp(-496 bp~-553 bp)的缺失;利用植物顺式作用元件数据库PLACE和PLANTCARE分析表明,2个品种启动子上除了含有TATA-box、CAAT-box等共有的转录必需调控元件外,‘中矮1号’中还含有一个‘锦香’没有的BPBF转录因子结合的P-box元件。推测‘中矮1号’PcAHS基因启动子上所特有的P-box转录因子结合元件和片段缺失可能是导致其表达量低的原因,并通过影响生长素的运输最终引起生长发育变化。
【关键词】：梨 矮生 转录组 生长素氢转运体 基因表达与分析
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S661.2;Q943.2
【目录】：

• 摘要6-7
• 英文摘要7-12
• 英文缩略表12-13
• 第一章 引言13-21
• 1.1 研究背景13-14
• 1.2 矮化机理的研究进展14-17
• 1.2.1 解刨特性与树体矮化14-15
• 1.2.2 同化物、矿质营养和水势与树体矮化15
• 1.2.3 主要氧化酶类与矮化的关系15-16
• 1.2.4 内源激素与树体矮化16
• 1.2.5 植株矮化遗传分析与基因调控16-17
• 1.2.6 木本植物矮化研究中存在的问题17
• 1.3 转录组含义17-18
• 1.4 转录组测序的应用18
• 1.5 转录组测序的步骤18-20
• 1.6 分析流程20
• 1.7 本实验的目的意义20-21
• 第二章 梨矮化相关基因分离21-35
• 2.1 试验材料21
• 2.2 试验方法21-24
• 2.2.1 RNA的提取21
• 2.2.2 cDNA文库构建21
• 2.2.3 测序21-22
• 2.2.4 序列组装22
• 2.2.5 微卫星的探测与功能注释22
• 2.2.6 转录组差异基因22
• 2.2.7 qRT-PCR22-24
• 2.3 结果与分析24-33
• 2.3.1‘中矮1号’与‘锦香’枝条发育情况24-26
• 2.3.2 转录组数据与分析26-31
• 2.3.3 qPCR分析31-33
• 2.4 讨论33-35
• 第三章‘中矮1号’梨PcAHS基因及其启动子克隆与分析35-43
• 3.1 试验材料35
• 3.2 试验方法35-37
• 3.2.1 总的RNA提取及逆转录35
• 3.2.2 PcAHS基因的克隆35-36
• 3.2.3 氨基酸同源性序列分析36
• 3.2.4 PcAHS基因的RT-PCR分析36
• 3.2.5 PcAHS基因的启动子克隆36
• 3.2.6 PcAHS基因启动子区域比对及顺式作用元件分析36-37
• 3.3 结果与分析37-41
• 3.3.1 PcAHS基因克隆与分析37-38
• 3.3.2 PcAHS基因的表达分析38
• 3.3.3 PcAHS基因启动子克隆与分析38-41
• 3.4 讨论41-43
• 第四章 全文结论43-44
• 参考文献44-51
• 致谢51-52
• 作者简历52

【参考文献】

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本文编号：799046