猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a功能的研究

发布时间：2017-09-18 18:34

  本文关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a功能的研究

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【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)属于RNA病毒中的单股正链RNA病毒,该病毒与马动脉炎病毒(equine arteritis virus,EAV)、猴出血热病毒(simian hemorrhagic fever virus,SHFV)和小鼠乳酸脱氢酶升高症病毒(lactate dehydrogenase-elevating virus,LDV)同属于动脉炎病毒属。PRRS V根据其基因型分为I型(欧洲)和II型(美洲),而国内的流行毒株主要为II型PRRSV。最新研究通过序列分析发现一个普遍存在于动脉炎病毒属的开放性阅读框—ORF5a,利用反向遗传操作系统对ORF5a的重要性进行验证,发现其对EAV起重要作用,并对PRRSV的存活是必需的。但是ORF5a是以何种方式起作用,具体的功能是什么尚不明确,有待进一步的研究。本研究利用反向遗传操作技术,对ORF5a的功能做进一步的探讨,为PRRSV的基础性研究奠定基础。本研究在实验室已有的PRRSV的感染性克隆质粒p Hu N4-F112上进行改造,将ORF5a的起始密码子ATG突变为GTG,构建了ORF5a失活的感染性克隆质粒p Hu N4-F112-Δ5a,体外转染BHK-21细胞后在MARC-145细胞上拯救病毒。结果表明,拯救毒株在MARC-145细胞上传代的第一代可以检测到PRRSV的基因组,但是检测不到病毒蛋白,证明ORF5a的存在是PRRSV存活所必需,并推测ORF5a可能参与病毒蛋白的合成。为了进一步验证ORF5a的功能,将ORF5a插入慢病毒表达载体(p WPXL)中与辅助质粒(p SPAX2、p MD2.G)共转染293T细胞,收获重组病毒,将病毒液上清纯化后感染MARC-145细胞,筛选得到稳定表达ORF5a细胞系,命名为5a M细胞系。将p Hu N4-F112-Δ5a在构建的5a M细胞系上拯救,得到复制缺陷型病毒,说明ORF5a蛋白的稳定表达可以补偿突变株p Hu N4-F112-Δ5a合成病毒粒子蛋白的功能,因而推测ORF5a可能参与病毒的蛋白翻译过程。将拯救出的病毒继续在5a M细胞系上传3代,得到具有感染性的病毒,对其各代基因组进行测序,发现p Hu N4-F112-Δ5a的突变位点发生回复突变—GTG重新变回ATG。另外,当p Hu N4-F112-Δ5a在MARC-145非冻融连续传代,其基因组会持续存在,但ORF5a的突变位点不能回复突变,说明5a M细胞系中ORF5a的补偿可以使突变株p Hu N4-F112-Δ5a的缺陷基因组回复突变形成了具有感染性的病毒粒子。综上所述,ORF5a蛋白失活导致病毒粒子蛋白不能合成,因而对PRRSV的存活是必需的,另外ORF5a的稳定表达使突变株p Hu N4-F112-Δ5a的突变位点GTG回复为ATG。
【关键词】：猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5a 感染性克隆 5aM细胞系 功能性研究
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.651
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文缩略表12-13
• 第一章 引言13-21
• 1.1 PRRSV的生物学特征13-17
• 1.1.1 PRRSV基因组结构以及亚基因的组成13-15
• 1.1.2 PRRSV主要的结构蛋白15-16
• 1.1.3 PRRSV的病毒侵入16-17
• 1.2 ORF5A的研究进展17-19
• 1.2.1 ORF5A的发现18
• 1.2.2 EAV中ORF5A的重要性18
• 1.2.3 PRRSV 中 PRF5a 的必需性18-19
• 1.3 反向遗传操作技术在动脉炎病毒属中的应用现状19-20
• 1.4 研究的目的和意义20-21
• 第二章 PRRSV ORF5A突变株的构建及生物学分析21-31
• 2.1 材料21
• 2.1.1 毒株、菌株、细胞21
• 2.1.2 主要试剂与仪器21
• 2.2 方法21-27
• 2.2.1 ORF5A相对位置分析21-22
• 2.2.2 引物设计及合成22
• 2.2.3 定点突变质粒的构建22-24
• 2.2.4 病毒的拯救24-25
• 2.2.5 拯救病毒感染性克隆缺失株RHUN4-F112-Δ5A鉴定及生物学分析25-27
• 2.3 结果27-29
• 2.3.1 拯救病毒PT-PCR检测结果27-28
• 2.3.2 拯救病毒突变位点鉴定结果28
• 2.3.3 拯救病毒蛋白检测结果28
• 2.3.4 拯救病毒病变观察的结果28-29
• 2.4 讨论29-30
• 2.5 小结30-31
• 第三章 PRRSV ORF5A细胞系的建立31-39
• 3.1 实验材料31
• 3.1.1 细胞、质粒、菌株31
• 3.1.2 主要的试剂及仪器31
• 3.2 实验方法31-36
• 3.2.1 目的片段表达载体的构建31-34
• 3.2.2 含有目的片段的MARC-145细胞系的建立34-35
• 3.2.3 含有目的片段的MARC-145细胞系的鉴定35-36
• 3.3 实验结果36-38
• 3.3.1 表达载体与辅助质粒的酶切鉴定结果36
• 3.3.2 构建质粒过程中的鉴定结果36-37
• 3.3.3 重组质粒 5A-PWPXL的鉴定结果37
• 3.3.4 细胞系的荧光结果37
• 3.3.5 细胞系的GFP蛋白的检测结果37-38
• 3.4 讨论38-39
• 第四章 缺陷株在 5AM细胞系上拯救及生物学分析39-48
• 4.1 实验材料39
• 4.1.1 细胞39
• 4.1.2 主要试剂及仪器39
• 4.2 实验方法39-42
• 4.2.1 补偿实验39-40
• 4.2.2 缺陷株在MARC-145细胞上的拯救及非冻融传代40-41
• 4.2.3 缺失株在 ORF5a 的 MARC-145 细胞系上拯救的鉴定及生物学特性分析41
• 4.2.4 ORF5a 蛋白免疫原性检测41-42
• 4.3 结果42-45
• 4.3.1 基因组的检测结果42-43
• 4.3.2 突变位点的鉴定43
• 4.3.3 细胞病变的观察43-44
• 4.3.4 细胞病变的观察44
• 4.3.5 ORF5a 蛋白的免疫原性鉴定结果44-45
• 4.4 讨论45-46
• 4.5 小结46-48
• 第五章 结论48-49
• 参考文献49-55
• 致谢55-56
• 作者简历56

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