仿刺参(Apostichopus japonicas)肠道再生期巨大芽孢杆菌对生长、免疫、消化及肠道菌群的作用
发布时间:2017-10-02 15:47
本文关键词:仿刺参(Apostichopus japonicas)肠道再生期巨大芽孢杆菌对生长、免疫、消化及肠道菌群的作用
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【摘要】:本论文采用传统平板涂布计数法结合HiSeq2000高通量16S rDNA序列分析技术研究在仿刺参肠道再生过程中巨大芽孢杆菌H1对其肠道菌群的影响。同时通过分析仿刺参肠道相关免疫酶活(酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶)和消化酶活(蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶)、生长指标(体重和特定生长率)等,结合灿烂弧菌人工拮抗试验,进一步研究巨大芽孢杆菌H1对肠道再生期仿刺参生长、免疫和消化的作用。实验结果证明巨大芽孢杆菌H1能够显著减少仿刺参肠道的弧菌数量;降低因病原弧菌引起的仿刺参排脏率;对仿刺参幼参具有很好的保护作用,其排脏保护率可达92.31%;同时提高仿刺参的特定生长率3.00±0.34倍。以上研究为巨大芽孢杆菌H1在仿刺参保苗养殖中的广泛应用提供了科学依据。所获得的主要研究结果如下:1.采用HiSeq2000高通量及传统平板涂布计数法发现:仿刺参幼参正常肠道细菌种类主要分布于变形菌门、浮霉菌门、放线菌门、厚壁菌门、疣微菌门、绿弯菌门、酸杆菌门等,其中变形菌门所占比例最大。肠道菌群是波动的,但是均以Y-变形菌纲为优势菌群,且其所占比例有不断增加的趋势。仿刺参正常肠道细菌的种类比再生期的更为丰富。2.由于发生排脏,再生期仿刺参肠道除变形菌门和拟杆菌门,其他种类细菌所占比重较小,γ-变形菌纲在再生的不同阶段其所占的比例均在70%以上。巨大芽孢杆菌H1影响再生肠道菌群的结构,实验组A(加巨大芽孢杆菌H1)的芽孢杆菌数量一直显著高于空白对照组C和实验组B(不加巨大芽孢杆菌H1)(P0.05),在再生后期(第25天)实验组A、实验组B及空白对照组C可培养的弧菌数量分别占可培养的总异养菌数79.15%、91.52%、71.17%。说明H1在仿刺参再生肠道内能有效定植(可达107CFU/g),并显著抑制弧菌的生长(P0.05)。3.分析了仿刺参肠道相关免疫酶活(酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶)和消化酶活(蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶),发现肠道再生初期的酸性磷酸酶ACP和碱性磷酸酶AKP水平均显著低于正常肠道,伴随着肠道再生,ACP和AKP水平逐渐提高,趋于正常水平。巨大芽孢杆菌Hl在再生初期对仿刺参肠道ACP和AKP具有一定抑制作用,但在再生后期具有显著促进ACP和AKP水平的作用(P0.05)。不同于ACP和AKP,再生期肠道SOD水平显著高于正常肠道,可能是再生初期仿刺参的一种自我保护。之后SOD水平随着肠道再生不断降低,接近于正常肠道的SOD活性。同样,巨大芽孢杆菌Hl在再生初期对仿刺参肠道SOD具有一定抑制作用。巨大芽孢杆菌H1对再生期仿刺参肠道蛋白酶和淀粉酶具有显著促进作用(P0.05),但是只在再生初期显著提高仿刺参肠道脂肪酶活性(P0.05)。4.处于肠道再生初期的仿刺参幼参其体质量显著下降,呈负生长状态。但在第10天,随着发现粪便的产生,表明幼参已初具消化能力且体重开始缓慢的上升,并在第12天呈正生长。水体中添加105 CFU/ml的巨大芽孢杆菌H1可显著促进仿刺参肠道再生期仿刺参特定生长率并增重(P0.05)。说明巨大芽孢杆菌H1可显著促进肠道再生期仿刺参的生长。5.在巨大芽孢杆菌H1 (5×106CFU/ml)人工拮抗灿烂弧菌(107CFU/ml)实验中,证实了巨大芽孢杆菌Hl具有很好的保护仿刺参幼参的作用,其保护率为92.31%。其中阳性对照组的排脏率为(43.33±5.77)%,拮抗组的排脏率仅为(3.33±2.89)%,两者差异极显著(P0.01)。由此可见,巨大芽孢杆菌H1在仿刺参养殖中将有良好的应用前景。
【关键词】:仿刺参 肠道再生 巨大芽孢杆菌 灿烂弧菌 免疫反应 消化酶
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S917.4
【目录】:
- 摘要5-7
- Abstract7-12
- 第一章 文献综述12-23
- 1. 仿刺参的分类地位及作用12
- 2. 仿刺参养殖现状12
- 3. 仿刺参特殊的生理特征12-14
- 3.1 休眠12-13
- 3.2 排脏13
- 3.3 再生13-14
- 4. 仿刺参再生期的免疫特征14-15
- 5. 仿刺参肠道消化酶的特征15
- 6. 仿刺参肠道菌群的特征15-16
- 7. 芽孢杆菌在水产养殖中的应用16-19
- 7.1 芽孢杆菌在水产养殖中的作用16-18
- 7.2. 巨大芽孢杆菌生物学特征及应用18-19
- 8. 高通量测序技术应用于微生物生态研究19-21
- 8.1 高通量测序与传统微生物培养方法的比较20
- 8.2 高通量测序与变性梯度凝胶电泳的比较20
- 8.3 16S rDNA通用引物的选择20-21
- 9. 本论文研究的目的及意义21-23
- 第二章 仿刺参肠道再生期间菌群结构的研究23-33
- 前言23-24
- 2.1 实验材料和仪器24-25
- 2.1.1 仿刺参幼参和菌株24
- 2.1.2 实验仪器24-25
- 2.1.3 实验培养基配制25
- 2.2 实验方法25-27
- 2.2.1 仿刺参肠道菌群DNA的提取与检测25-26
- 2.2.2 16S rDNA-V4片段的扩增及高通量测序26
- 2.2.3 稀释平板涂布法分析仿刺参肠道再生期肠道主要菌群26-27
- 2.3 实验结果27-31
- 2.3.1 高通量测序分析仿刺参正常肠道与再生期肠道菌群结构27-30
- 2.3.2 稀释平板涂布法分析仿刺参肠道再生期肠道主要菌群30-31
- 2.4 讨论31-33
- 第三章 仿刺参肠道再生期间肠道免疫及消化能力的研究33-48
- 3.1 实验材料和仪器33-34
- 3.1.1 仿刺参幼参和菌株33-34
- 3.1.2 实验仪器34
- 3.2. 实验方法34-42
- 3.2.1 蛋白定量测定的方法34-35
- 3.2.2 碱性磷酸酶(AKP)的测定方法35
- 3.2.3 酸性磷酸酶(ACP)的测定方法35-36
- 3.2.4 总超氧化物歧化酶(T-SOD)测定方法36-37
- 3.2.5 蛋白酶的测定方法37-39
- 3.2.6 脂肪酶活力的测定39-40
- 3.2.7 淀粉酶活力的测定40-42
- 3.3 实验结果42-46
- 3.3.1 仿刺参肠道再生期肠道酸性磷酸酶ACP的比活力变化42
- 3.3.2 仿刺参肠道再生期肠道碱性磷酸酶AKP的比活力变化42-43
- 3.3.3 仿刺参肠道再生期中肠道超氧化物歧化酶SOD的比活力变化43
- 3.3.4 仿刺参肠道再生期肠道蛋白酶的比活力变化43-44
- 3.3.5 仿刺参肠道再生期肠道淀粉酶的比活力变化44-45
- 3.3.6 仿刺参肠道再期肠道脂肪酶的比活力变化45-46
- 3.4 讨论46-48
- 第四章 仿刺参肠道再生期的生长及灿烂弧菌拮抗实验48-54
- 4.1 实验材料和仪器48-49
- 4.1.1 仿刺参幼参和菌株48
- 4.1.2 实验仪器48-49
- 4.2 实验方法49
- 4.2.1 仿刺参肠道再生期的生长和特定生长率的测定49
- 4.2.2 灿烂弧菌人工拮抗试验49
- 4.3 结果49-52
- 4.3.1 仿刺参肠道再生对体重和特定生长率的影响49-51
- 4.3.2 仿刺参肠道再生期(第10天)肠道解剖图51
- 4.3.3 灿烂弧菌人工拮抗试验51-52
- 4.4 讨论52-54
- 论文总结54-56
- 参考文献56-61
- 致谢61-62
- 个人简历62-63
- 发表的学术论文63
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