长春花转录组与萜类吲哚生物碱代谢途径研究

发布时间：2017-10-04 06:05

  本文关键词：长春花转录组与萜类吲哚生物碱代谢途径研究

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【摘要】：长春花是抗肿瘤药物长春碱和长春新碱的唯一植物来源,也是研究萜类吲哚生物碱(TIA)生物合成与调控的模式物种。本研究分别利用Illumina二代测序技术和PacBio三代测序技术对长春花的叶、花和根的转录组进行了测序和分析。通过Illumina测序共得到140,787,121条短reads,经de novo拼接获得191,167条inigenes,平均长度674bp。基因注释发现了许多参与不同生物学过程和具有不同功能的基因,56.12%的基因在与7大数据库的比对中显示出同源性。GO分类鉴定出261个与次生代谢有关的基因,KOG分类鉴定出1809个与次生代谢合成、转运和分解有关的基因,KEGG注释鉴定出604个与萜类合成有关的基因及12个与吲哚生物碱合成有关的基因。差异表达分析结果显示,大多数TIAs途径相关基因在根和叶中的表达量较高,而文多灵途径的特有基因则在地上部分具有较高的表达量。因此,根据与已知基因的共表达原理,筛选出可能参与TIAs生物合成的8个P450候选基因和5个功能基因。三代测序共获得786,008条长reads,其中花264,553条、根262,140条、叶259,315条。经数据处理,得到全长转录本(full-length reads) 378,581条(花：123,665条、根：120,510条、叶：134,406条),非全长转录本(non-full-length reads)311,081条(花：105,613条、根：106,459条、叶：99,009条)。通过比对全长转录本序列,分析转录因子及已知的长春花TIAs途径催化酶编码基因,发现了一些可能的可变剪切形式,提示可变剪切可能参与TIAs生物合成途径的调控。采用不同平台进行的大规模转录组测序为研究长春花特殊的次生代谢产物合成途径提供了丰富的数据资源,PacBio三代测序技术在读长上的优势也使得分析可变剪切及探究可变剪切对TIAs途径相关基因表达调控的影响成为了可能。本研究还初步探索了通过在酿酒母中重构TIAs合成途径生产TIAs的可行性。首先通过转录组数据分析发现酿酒酵母稀有密码子在长春花基因中的使用频率偏低,推测长春花基因适合在酿酒酵母中进行表达。克隆了10个已知的环烯醚萜途径催化酶基因,经序列比对发现,除CPR、DLGT、IRS 和 LAMT存在个别碱基的差异外,其余序列均与GenBank序列完全一致。采用SOE-PCR法构建催化环烯醚萜途径前两步反应的GES、G10H 和 CPR表达模块,通过酵母体内重组方法构建三元表达载体,建立从元件选择、模块构建到多模块体内重组的技术流程,为实现完整TIAs合成途径在酵母中的重建奠定技术基础。
【关键词】：长春花 转录组 高通量测序 萜类吲哚生物碱 环烯醚萜途径
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S567.19;Q943.2
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-9
• 第一章 前言9-27
• 1.1 转录组测序技术及研究进展9-14
• 1.1.1 测序技术的历史与发展9-13
• 1.1.2 高通量转录组测序研究进展13-14
• 1.2 长春花转录组与萜类吲哚生物碱代谢途径研究进展14-25
• 1.2.1 长春花转录组研究进展15-16
• 1.2.2 长春花萜类吲哚生物碱代谢途径的解析16-22
• 1.2.3 长春花萜类吲哚生物碱代谢途径的调控22-25
• 1.3 合成生物学与天然产物的异源合成25-27
• 1.3.1 合成生物学的概念与研究思路25-26
• 1.3.2 合成生物学在天然产物异源合成研究中的应用26-27
• 第二章 研究材料与方法27-44
• 2.1 材料、试剂与设备27-29
• 2.1.1 植物材料27
• 2.1.2 试剂27-28
• 2.1.2.1 总RNA提取、反转录和均一化27
• 2.1.2.2 转录组测序27
• 2.1.2.3 PCR、电泳和载体构建27-28
• 2.1.3 主要设备28-29
• 2.1.3.1 总RNA提取、反转录和均一化28
• 2.1.3.2 转录组测序28
• 2.1.3.3 PCR、电泳和载体构建28-29
• 2.2 方法29-44
• 2.2.1 PacBio三代转录组测序29-39
• 2.2.1.1 总RNA的提取29
• 2.2.1.2 反转录与cDNA均一化29-37
• 2.2.1.3 片段分选37-38
• 2.2.1.4 文库构建与测序38-39
• 2.2.1.5 数据处理与分析39
• 2.2.2 Illumina二代转录组测序39-40
• 2.2.2.1 总RNA的提取39
• 2.2.2.2 文库构建与测序39
• 2.2.2.3 数据处理与分析39-40
• 2.2.3 代谢途径关键酶基因的克隆与载体构建40-44
• 2.2.3.1 基因克隆40-42
• 2.2.3.2 载体构建42-44
• 第三章 结果与讨论44-72
• 3.1 基于Illumina二代测序平台的长春花转录组分析44-57
• 3.1.1 测序数据的质量评估与预处理44-45
• 3.1.2 转录本拼接45-46
• 3.1.3 基因功能注释46-50
• 3.1.4 SSR分析50-51
• 3.1.5 差异表达分析51-55
• 3.1.6 TIAs途径基因表达差异分析及基因挖掘55-57
• 3.2 基于PacBio三代测序平台的可变剪切分析57-60
• 3.2.1 PacBio三代测序与全长转录本57-59
• 3.2.2 TIAs合成途径相关转录因子及催化酶编码基因的可变剪切59-60
• 3.3 基于转录组数据的密码子使用偏好性分析60-64
• 3.3.1 通过转录组数据进行密码子使用偏好性分析的可行性60-61
• 3.3.2 基于转录组的长春花密码子偏好性分析61-64
• 3.3.2.1 长春花基因密码子的GC含量分析61
• 3.3.2.2 长春花基因有效密码子数(ENC)分析61-62
• 3.3.2.3 长春花基因最优密码子分析62-64
• 3.4 环烯醚萜的途径关键酶基因的克隆与载体构建64-72
• 3.4.1 环烯醚萜途径关键酶基因的克隆64-67
• 3.4.2 SOE-PCR法构建表达模块67-72
• 第四章 结论72-73
• 参考文献73-87
• 缩略词87-88
• 附录88-108
• 致谢108-109
• 作者简历109

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 朱孝轩;朱英杰;宋经元;孙超;陈士林;;基于全基因组和转录组分析的赤芝密码子使用偏好性比较研究[J];药学学报;2014年09期

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本文编号：969008