siRNA沉默ERK5基因对MC3T3-E1成骨细胞增殖及BMP2/BMP7的影响
发布时间：2021-08-17 18:37
目的观察ERK5信号通路对MC3T3-E1成骨细胞的增殖,及功能分化蛋白BMP2/BMP7的影响。方法应用小RNA分子干扰技术（siRNA）沉默ERK5基因,分别将浓度为20、40、60、80 nmol/L的ERK5 siRNA干预MC3T3-E1成骨细胞,筛选ERK5 siRNA转染的最佳浓度。噻唑蓝实验（MTT）检测转染后12 h、24 h、36 h和48 h细胞的增殖情况,实时荧光定量PCR检测ERK5、BMP2和BMP7 mRNA的表达。Westernblot检测不同干预组BMP2及BMP7蛋白的表达变化。结果当ERK5siRNA浓度为60 nmol/L时,MC3T3-E1成骨细胞的ERK5 mRNA的表达下降最为显著,沉默率为76.8±2.2%（P<0.01）。ERK5 siRNA转染后12 h、24 h、36 h,成骨细胞的增殖受到明显抑制（P<0.05）,但48 h转染组未发现明显变化（P>0.05）。ERK5 siRNA转染24 h后,实时荧光定量PCR结果显示:空白组与对照siRNA组成骨细胞的BMP2/BMP7 mRNA变化水平无显著性差异（P&g...
【文章来源】：中国骨质疏松杂志. 2014,20(09)北大核心CSCD
【文章页数】：4 页
【部分图文】：
不同浓度siEＲK5对EＲK5mＲNA表达的影响
24h组0.455±0.0190.449±0.043a0.371±0.061b36h组0.522±0.0230.518±0.029a0.444±0.057b48h组0.634±0.0140.631±0.041a0.608±0.028注:a:与空白组相比，P＞0.05;b:与对照siＲNA组相比，P＜0.05;a:Comparedwithblankgroup，P＞0.05;b:ComparedwithsiＲNAcontrolgroup，P＜0.05．2.3EＲK5siＲNA转染对MC3T3－E1成骨细胞BMP2、BMP7mＲNA表达的影响ＲT-PCＲ检测60nmol/L的siEＲK5转染成骨细胞24h后，结果显示:转染后成骨细胞BMP2、BMP7mＲNA水平明显下降，且统计学有显著性差异(P＜0.05)(图2)。图2siEＲK5转染成骨细胞BMP2/BMP7mＲNA表达的影响注:*与空白组和对照组相比有显著性差异，P＜0.05Fig．2TheeffectofEＲK5siＲNAontheexpressionofBMP2/BMP7mＲNAinosteoblasts(*:comparedwiththeblankgroupandsiＲNAcontrolgroups，P＜0.05)2.4siEＲK5转染对MC3T3-E1成骨细胞BMP2、BMP7蛋白表达的影响Westernblot结果显示，空白组与对照siＲNA组的BMP2、BMP7没有显著性变化，而60nmol/L的siEＲK5转染后，MC3T3-E1成骨细胞的BMP2、BMP7明显降低(图3)。3讨论骨形态发生蛋白是最为引人注目的一组新型骨生长因子，能够有效地促进成骨细胞的增殖分化，其在预防骨质疏松、加快骨折愈合、修补骨缺损等领域中国骨质疏松杂志2014年9月第20卷第9期ChinJOsteoporos，September2014，Vol20，No．91057
图3Westernblot检测不同干预组BMP2/BMP7蛋白的表达Fig．3TheexpressionofBMP2/BMP7proteinindifferenttreatmentgroupsusingWesternblotting中有较为广泛的应用，目前共分离出20余种BMPs。以往研究表明，BMPs主要通过经典的Smad信号通路传递信号，从而发挥其生物学的功能［6］。近年来发现，BMPs还可以通过MAPKs、PI3K等通路进行信号转导，因此称之为BMPs的非经典信号通路［7］。EＲK5信号通路是MAPKs家族发现最晚的通路，也是目前研究最少的一条通路。EＲK5磷酸化依次通过MEKK2/3，MKK5级联反应激活，激活后进入细胞核内，其C端的具有转录活性的丝氨酸、苏氨酸与N端的共同作用下激活c-Fos、c-Jun以及AP-1等转化因子，从而促进细胞的增殖分化。目前研究已证实，EＲK5在内皮细胞增生、迁移以及新血管形成中发挥关键作用，EＲK5基因缺失的小鼠将死于胚胎早期脉管内皮组织系统发育障碍［3，8］。另外，EＲK5不仅调节正常细胞功能中发挥重要作用，也介导病理细胞的增殖和凋亡。Kim［9］研究发现，沉默EＲK5基因后，骨肿瘤的侵袭性以及金属蛋白酶(MMP9)明显减少。同时，Kato［10］以及Ｒamsay［11］分别在宫颈癌Hela细胞以及人前列腺癌PC3细胞的中，发现了EＲK5的重要性，并大胆预测了EＲK5可能是未来治疗恶性肿瘤的一个重要的靶点。该结果同样也在人成骨肉瘤细胞MG63中得到证实，程［12］发现，EＲK5信号通路介导了白介素6对MG63细胞的增殖分化。然而，EＲK5是否调节正常骨细胞的生理功能目前鲜有报道。siＲNA技术是利用具有同源性的双链ＲNA诱导沉默序列特异的目的基因，并迅速阻断该基因的活性，从而观察该基因对细胞的影响。本研究采用siＲNA干扰技术，沉默MAＲKs家族中EＲK5基因的表达，初步?
【参考文献】：
期刊论文
[1]ERK5调节成骨细胞功能的研究[J]. 程群,朱汉民,甘洁民,缪应新,施泓. 中国骨质疏松杂志. 2008(12)
本文编号：3348280
【文章来源】：中国骨质疏松杂志. 2014,20(09)北大核心CSCD
【文章页数】：4 页
【部分图文】：
不同浓度siEＲK5对EＲK5mＲNA表达的影响
24h组0.455±0.0190.449±0.043a0.371±0.061b36h组0.522±0.0230.518±0.029a0.444±0.057b48h组0.634±0.0140.631±0.041a0.608±0.028注:a:与空白组相比，P＞0.05;b:与对照siＲNA组相比，P＜0.05;a:Comparedwithblankgroup，P＞0.05;b:ComparedwithsiＲNAcontrolgroup，P＜0.05．2.3EＲK5siＲNA转染对MC3T3－E1成骨细胞BMP2、BMP7mＲNA表达的影响ＲT-PCＲ检测60nmol/L的siEＲK5转染成骨细胞24h后，结果显示:转染后成骨细胞BMP2、BMP7mＲNA水平明显下降，且统计学有显著性差异(P＜0.05)(图2)。图2siEＲK5转染成骨细胞BMP2/BMP7mＲNA表达的影响注:*与空白组和对照组相比有显著性差异，P＜0.05Fig．2TheeffectofEＲK5siＲNAontheexpressionofBMP2/BMP7mＲNAinosteoblasts(*:comparedwiththeblankgroupandsiＲNAcontrolgroups，P＜0.05)2.4siEＲK5转染对MC3T3-E1成骨细胞BMP2、BMP7蛋白表达的影响Westernblot结果显示，空白组与对照siＲNA组的BMP2、BMP7没有显著性变化，而60nmol/L的siEＲK5转染后，MC3T3-E1成骨细胞的BMP2、BMP7明显降低(图3)。3讨论骨形态发生蛋白是最为引人注目的一组新型骨生长因子，能够有效地促进成骨细胞的增殖分化，其在预防骨质疏松、加快骨折愈合、修补骨缺损等领域中国骨质疏松杂志2014年9月第20卷第9期ChinJOsteoporos，September2014，Vol20，No．91057
图3Westernblot检测不同干预组BMP2/BMP7蛋白的表达Fig．3TheexpressionofBMP2/BMP7proteinindifferenttreatmentgroupsusingWesternblotting中有较为广泛的应用，目前共分离出20余种BMPs。以往研究表明，BMPs主要通过经典的Smad信号通路传递信号，从而发挥其生物学的功能［6］。近年来发现，BMPs还可以通过MAPKs、PI3K等通路进行信号转导，因此称之为BMPs的非经典信号通路［7］。EＲK5信号通路是MAPKs家族发现最晚的通路，也是目前研究最少的一条通路。EＲK5磷酸化依次通过MEKK2/3，MKK5级联反应激活，激活后进入细胞核内，其C端的具有转录活性的丝氨酸、苏氨酸与N端的共同作用下激活c-Fos、c-Jun以及AP-1等转化因子，从而促进细胞的增殖分化。目前研究已证实，EＲK5在内皮细胞增生、迁移以及新血管形成中发挥关键作用，EＲK5基因缺失的小鼠将死于胚胎早期脉管内皮组织系统发育障碍［3，8］。另外，EＲK5不仅调节正常细胞功能中发挥重要作用，也介导病理细胞的增殖和凋亡。Kim［9］研究发现，沉默EＲK5基因后，骨肿瘤的侵袭性以及金属蛋白酶(MMP9)明显减少。同时，Kato［10］以及Ｒamsay［11］分别在宫颈癌Hela细胞以及人前列腺癌PC3细胞的中，发现了EＲK5的重要性，并大胆预测了EＲK5可能是未来治疗恶性肿瘤的一个重要的靶点。该结果同样也在人成骨肉瘤细胞MG63中得到证实，程［12］发现，EＲK5信号通路介导了白介素6对MG63细胞的增殖分化。然而，EＲK5是否调节正常骨细胞的生理功能目前鲜有报道。siＲNA技术是利用具有同源性的双链ＲNA诱导沉默序列特异的目的基因，并迅速阻断该基因的活性，从而观察该基因对细胞的影响。本研究采用siＲNA干扰技术，沉默MAＲKs家族中EＲK5基因的表达，初步?
【参考文献】：
期刊论文
[1]ERK5调节成骨细胞功能的研究[J]. 程群,朱汉民,甘洁民,缪应新,施泓. 中国骨质疏松杂志. 2008(12)
本文编号：3348280
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