恶性疟原虫GBP130基因5’近端侧翼序列调控功能的研究

发布时间：2021-08-18 06:07

　　早在1897年Ronald Ross就发现疟疾是蚊媒传播的疾病，100余年后的今天，疟疾仍然是人类健康的主要威胁之一。对各种疟原虫基因及其基因产物的功能研究是发现有效疫苗候选抗原和抗疟药物作用靶位的必要前提。基因敲除可为蛋白功能提供重要的信息，但其所反映的信息只是全有或全无的。对疟原虫有重要功能的蛋白基因不能通过基因敲除来研究，否则会导致疟原虫的死亡而无法研究，如MSP1和AMA-1。因此，需要建立一种可诱导性转基因表达系统，以有效控制基因的表达。 目前认为四环素诱导表达系统是最有前途的诱导性系统。GBP130是主要于滋养体期转录的期特异性基因，该基因启动子含有单一的转录起始点，有利于在其附近插入四环素识别调控元件。对GBP130的5’侧翼序列进行分析，发现具有高转录活性的最小调控序列，以及可能的期特异性和非期特异性调控元件，进而还可以建立期特异性和非期特异性诱导表达系统。已有研究认为GBP130的5’侧翼序列的转录起始点上游不存在期特异性调控元件，但转录起始点下游是否具有期特异性调控功能还不清楚。 本研究建立了一种有效的疟原虫瞬时基因转染系统，将GBP130基因5’近端侧... 

【文章来源】：中国人民解放军空军军医大学陕西省 211工程院校

【文章页数】：83 页

【学位级别】：硕士

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文献回顾
    1 疟原虫基因转染的研究进展
        1.1 疟原虫基因转染的种类
            1.1.1 瞬时转染
            1.1.2 稳定转染
                1.1.2.1 附加体型的稳定转染
                1.1.2.2 整合型的稳定转染
        1.2 转染虫体中质粒载体的分子生物学特征
        1.3 疟原虫基因传染的方法学
            1.3.1 疟原虫转染载体的主要构件
                1.3.1.1 调控序列
                1.3.1.2 报告基因
                1.3.1.3 筛选标记
            1.3.2 转染方法
            1.3.3 转染效率
            1.3.4 转染子的鉴定
        1.4 疟原虫基因转染的应用
            1.4.1 基因表达调控
            1.4.2 基因功能研究
            1.4.3 药物研究
            1.4.4 疫苗研究
            1.4.5 细胞生物学
        1.5 结 语
    2 疟原虫基因表达调控研究现状
        2.1 疟原虫基本的分子生物学
            2.1.1 疟原虫的进化
            2.1.2 基因组
                2.1.2.1 基因组大小
                2.1.2.2 碱基组成
        2.2 疟原虫基因表达调控的策略
            2.2.1 发育性调控
            2.2.2 多级水平协同调控
            2.2.3 转录前调控
                2.2.3.1 染色体大小的变化
                2.3.3.2 组蛋白乙酰化
                2.2.3.3 染色体构象与转录
                2.2.3.4 染色体的结构
            2.2.4 转录水平的调控
                2.2.4.1 RNA聚合酶
                2.2.4.2 转录起始位点
                2.2.4.3 顺式作用元件
                2.2.4.4 反式作用因子
                2.2.4.5 顺式作用元件与反式作用因子的相互作用
            2.2.5 转录后水平的调控
                2.2.5.1 5’非翻译区
                2.2.5.2 RNA剪接
                2.2.5.3 3’非翻译区
            2.2.6 翻译水平的调控
            2.2.7 翻译后水平的调控
研究内容
第一部分 恶性疟原虫瞬时基因转染系统的建立
    1 材料与方法
        1.1 材 料
            1.1.1 培养原虫
            1.1.2 菌株
            1.1.3 载体
            1.1.4.3 商品化试剂盒
            1.1.4.4 试剂
            1.1.5 仪器
        1.2 方法
            1.2.1 红内期疟原虫体外连续培养
            1.2.2 疟原虫同步化处理
            1.2.3 质粒的大量提取和纯化
            1.2.4 P．f瞬时转染系统的建立
                1.2.4.1 红内期疟原虫的转染
                1.2.4.2 转染虫体细胞抽提物的制备
                1.2.4.3 CAT活性的检测
    2 结 果
第二部分 GBP130基因5’近端侧翼序列基因表达调控的初步研究
    1 材料与方法
        1.1 材 料
            1.1.1 培养原虫、菌株及载体
            1.1.2 试剂及仪器
            1.1.3 序列及引物
        1.2 方法
            1.2.1 红内期疟原虫体外连续培养、同步化处理及质粒的大量提取和纯化
            1.2.2 pGBPΔ2/615的构建
                1.2.2.1 目的片段（F_（615））的PCR扩增和纯化
                1.2.2.2 重组质粒pUC/615的构建及测序分析
                1.2.2.3 重组质粒pGBPΔ2/615的构建
            1.2.3 疟原虫转染分析
    2 结 果
        2.1 pGBPΔ2/615的构建
            2.1.1 F_（615）目的片段的PCR扩增和纯化
            2.1.2 重组质粒pUC/615的构建及测序分析
            2.1.3 重组质粒pGBPΔ2/615的构建
        2.2 GBP1305’近端侧翼序列调控功能的初步分析
第三部分 GBP130基因5’近端侧翼序列强度和期特异性调控的研究
    1 材料与方法
        1.1 材 料
        1.2 方法
            1.2.1 红内期疟原虫体外连续培养、同步化处理及质粒的大量提取和纯化
            1.2.2 pGBPΔ2/400和pGBPΔ2/800的构建
                1.2.2.1 目的片段的PCR扩增和纯化
                    F_（400）的扩增
                    F_（800）的扩增
                1.2.2.2 pGBPΔ2/400和pGBPΔ2/800的构建
                    pGBPΔ2/400的构建及筛选
                    pGBPΔ2/800的构建及筛选
                1.2.2.3 pUC/400和pUC/800的构建及测序分析
            1.2.3 疟原虫转染分析
                1.2.3.1 近端序列不同区域调控强度的分析
                1.2.3.2 近端序列不同区域调控期特异性的分析
    2 结 果
        2.1 pGBPΔ2/400和pGBPΔ2/800的构建
            2.1.1 目的片段的PCR扩增和纯化
            2.1.2 pGBPΔ2/400的构建及筛选
            2.1.3 pGBPΔ2/800的构建及筛选
        2.2 pUC/400和pUC/800的构建及测序分析
        2.3 GBP130基因5’近端侧翼序列调控功能的分析
            2.3.1 强度调控分析
            2.3.2 期特异性调控分析
    讨论
        1 P．f瞬时转染系统的建立
        2 质粒的构建
        3 GBP130基因5’近端侧翼序列的调控
            3.1 强度调控
            3.2 期特异性调控
小结
参考文献
致谢
附录： 研究生期间发表论文及译文情况


【参考文献】：
期刊论文
[1]恶性疟原虫GBP130基因5′侧翼序列近端片段调控功能的初步研究[J]. 王宪锋,刘忠湘,薛采芳,缪军,李珣,甄荣芬,刘军.  地方病通报. 2001(02)
[2]恶性疟原虫红细胞膜蛋白 1在疟原虫免疫逃避中的作用[J]. 王宪锋,薛采芳,甄荣芳.  地方病通报. 2000(02)
[3]硫酸软骨素A介导的恶性疟原虫感染的红细胞粘附[J]. 高美丽,王宪锋,杨建雄.  陕西师范大学学报(自然科学版). 2000(01)
[4]基因敲除技术与疟原虫基因功能研究[J]. 叶苓.  国外医学(寄生虫病分册). 1999(04)
[5]脂质体法和电穿孔法转染哺乳动物细胞研究[J]. 钱锋,肖成祖.  生物化学与生物物理进展. 1999(03)
[6]基因靶位操作的原理与策略[J]. 汪亚平,朱作言.  遗传. 1999(03)
[7]绿色荧光蛋白在生命科学研究中的应用[J]. 贺竹梅,李华平,李宝健,李志芳,黄定华.  遗传. 1998(05)
[8]研究活细胞生命现象的新途径──绿色荧光蛋白基因的重组与表达[J]. 田竟生,吴晓菁,潘海燕.  首都医科大学学报. 1998(03)
[9]活细胞的分子探针——绿色荧光蛋白[J]. 何琪杨,张鸿卿,薛绍白.  国外医学(分子生物学分册). 1997(06)



本文编号：3349346