约氏疟原虫药物减毒子孢子疫苗诱导虫期特异性免疫保护作用机制的研究

发布时间：2018-03-29 21:11

本文选题：疟疾　切入点：疫苗　出处：《第三军医大学》2014年博士论文

【摘要】：疟疾是全球危害最为严重的三大传染病之一。抗疟药耐药性的日趋严重以及其他有限的疟疾防止措施使疟疾疫苗的研制工作变得更为迫切。红前期是疟原虫感染人体的第一个时期，而且红前期并不引起明显的临床症状，因而，红前期是疟疾疫苗研制最为理想的时期。疟原虫减毒子孢子疫苗可以诱导针对疟疾红前期的完全免疫保护。放射减毒子孢子(Radiation-attenuated sporozoite, RAS)的相关研究显示，感染疟原虫的按蚊经过放射减毒处理后通过叮咬的方式免疫人体，大约1000个按蚊的叮咬可以诱导人体对疟原虫感染的完全保护作用。同时实验证实，基于氯喹和其它抗疟药治疗的药物减毒子孢子疫苗(infection-treatment-vaccination, ITV)也能够诱导小鼠或者人群对子孢子(sporozoite, SPZ)攻击的完全保护，而且ITV的免疫方式所需要的SPZ量比RAS更少。有研究发现，基于氯喹(chloroquine, CQ)的ITV在通过15个感染按蚊的3次叮咬后可以介导人体对疟原虫感染的完全保护作用。这说明ITV的免疫方式和RAS相比具有更强的抗原性。然而，目前ITV疫苗研究中所使用的大部分药物如氯喹等因为全球范围的抗药性及副作用大等缺点阻碍了其应用于现场的可能。青蒿素联合疗法是目前治疗疟疾的一线用药，青蒿素能更为迅速而且可以杀灭红内期疟原虫的各个时期，虽然近几年关于青蒿素耐药性的报道逐渐增多，但是目前并无对青蒿素的完全耐药即并无抗性株被分离鉴定。青蒿素及其衍生物与氯喹相似，均为通过杀死红内期疟原虫来控制疟疾的症状，但是青蒿素及其衍生物与氯喹的杀虫作用又有不尽相同之处：氯喹仅能杀伤滋养体期以后时期的疟原虫，而青蒿素及其衍生物却可以杀伤全部红内期的疟原虫，包括早期的环状体。本研究首先验证了青蒿素衍生物青蒿琥酯(artesunate,AS)作为ITV候选药物的可能，然后比较氯喹及青蒿琥酯ITV两种免疫方式所介导的免疫保护性的差异，深入研究了造成两种药物免疫保护差异性的机制。本项目利用约氏疟原虫/小鼠感染模型，通过尾静脉接种SPZ后给予青蒿琥酯或者氯喹控制红内期疟原虫的感染，免疫后给予SPZ或者感染红细胞攻击，验证其保护性。发现青蒿琥酯组小鼠仅对SPZ的攻击有免疫，而氯喹组小鼠对SPZ及红内期的攻击均有免疫。然后，我们研究了青蒿琥酯及氯喹两种不同药物处理因素诱导产生免疫保护差异性的机制。利用ELISA和IFA试验比较两组小鼠抗体的差异性，并通过血清过继转移试验及体外子孢子入侵试验从功能上验证血清在免疫保护性中发挥的作用。最后利用流式细胞分析技术检测了肝脏及脾脏淋巴细胞表型在免疫过程中的表达变化，，并通过体外肝期疟原虫发育抑制试验证实CD8+T细胞在红前期保护性中的作用。具体的研究结果如下： 1、在第一次免疫过程中，氯喹组小鼠在给药期间第4、5天出现可见的原虫血症，但是原虫血症比例在1%以下，第6天原虫血症消失。但是在停药第4天后，原虫血症再次出现，并且提高CQ的给药剂量，该现象仍然存在。但是高剂量的青蒿琥酯组却能完全杀灭红内期的感染。第一次免疫后11，14，18和24天通过RT-qPCR检测疟原虫18SrRNA的结果与血涂片检测的结果相吻合。第二次免疫和第三免疫时氯喹组和青蒿琥酯组均未出现原虫血症，经过3次免疫后，两组小鼠均能产生针对约氏疟原虫SPZ攻击的100%的免疫保护性，并且该保护性能持续至少6个月。而且，氯喹组不仅能够诱发小鼠产生红前期特异的保护作用，而且也能诱导一定的红内期的保护作用，61.5%的小鼠在感染红细胞攻击后未出现原虫血症。但是，青蒿琥酯组小鼠仅对SPZ的攻击有保护性。该现象说明青蒿琥酯组小鼠所介导的保护性是红前期特异的，而氯喹组小鼠不仅产生了对红前期的免疫保护，对红内期也产生了一定的免疫保护作用。 2、氯喹组及青蒿琥酯组小鼠抗红内期特异抗体的表达存在很大的差异。IFA及ELISA的实验证明青蒿琥酯组小鼠并未产生抗红内期的抗体，而氯喹组不仅产生了红内期特异的抗体，并且低剂量红内期感染所介导的抗体反应足以对红内期疟原虫起到杀伤作用。这就说明抗体在两组免疫小鼠的保护性差异中发挥了重要的作用。 3、氯喹组及青蒿琥酯组小鼠在免疫期间均表现出相似的肝脏CD8+Tem细胞的增殖，并且随着免疫次数的增加而增加。在3次免疫后，青蒿琥酯组小鼠CD8+Tem细胞的比例与第一次免疫后相比约增加了1.8倍，氯喹组小鼠CD8+Tem细胞的比例与第一次免疫后相比约增加了1.4倍。同时CSP特异的CD8+Tem细胞的表达在攻击前后增加了2.4-3.7倍，但是氯喹组和青蒿琥酯组之间并无明显差异。说明CD8+Tem细胞在ITV免疫小鼠的红前期免疫保护中发挥了重要的作用，但是并不是介导两组小鼠保护性差异的主要因素。 4、我们构建了体外实验平台，能够定量的检测CD8+T细胞对感染肝细胞的杀伤性的效应。在与500k CD8+T细胞共培养后，蚊唾液腺免疫对照组检测到约34.9%的非特异性抑制作用，但是氯喹组及青蒿琥酯组均表现出大于80%的抑制作用。该平台可以定量评价CD8+T细胞的功能，为以后高通量CD8+T细胞的功能研究提供重要的实验平台。我们的研究结果证实了青蒿琥酯可以作为ITV免疫模型的治疗药物，青蒿琥酯对红内期疟原虫的杀伤性与疟原虫攻击的数量及药物的剂量相关，说明青蒿琥酯诱导的疟原虫期特异性的保护是药物剂量依赖的。我们首次通过试验证实氯喹治疗的药物减毒子孢子疫苗所介导的免疫保护性并不是红前期特异的，免疫过程中低剂量的红内期感染介导了其产生红内期特异的免疫保护。两种药物ITV介导的免疫保护均是由抗体和T细胞所共同介导的，CD8+Tem是介导红前期免疫保护作用的关键因素，而抗体也在这个过程中发挥了一定的作用。抗体是介导青蒿琥酯及氯喹两种不同药物处理因素诱导产生免疫保护差异性最主要的原因。我们的研究为药物减毒子孢子的临床应用提供了新的候选药物模型，为今后研究红前期抗原的筛选和红前期特异的免疫保护机制提供了新的模型，并对ITV介导的免疫保护机制提供了新的理论依据。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R531.3

【共引文献】