白念珠菌Rps4p和Ste18p的功能研究

发布时间：2018-04-04 19:57

本文选题：白念珠菌　切入点：核糖体蛋白S4　出处：《第二军医大学》2013年博士论文

【摘要】：白念珠菌是重要的机会性致病真菌。它可以引起包括粘膜感染和危及生命的系统性疾病等多种疾病。最近几年，随着免疫抑制剂治疗的增加，长期的导尿技术的运用，以及广谱抗生素的使用，导致了念珠菌感染病例的逐年上升，其中白念珠菌占了很高的比例。白念珠菌作为具有多种形态的真菌，一种重要的形态转换就是在各种菌丝诱导条件下从单一细胞的酵母态转变为多细胞的菌丝态。白念珠菌的这种“酵母—菌丝”形态转变在白念珠菌被膜的形成过程中起着至关重要的作用。白念珠菌的另一种形态转换是在纯合子的状态下，从白色形态到不透明态的转换，这种转换在白念珠菌的交配过程中起着重要的作用。核糖体是细胞合成蛋白质的重要场所。成熟的核糖体由核糖体RNA(rRNA)和核糖体蛋白（RP）组成。核糖体蛋白是核糖体的重要组成部分，其主要功能是保证蛋白质合成的顺利进行。在真核生物中，缺失胞浆核糖体蛋白将会导致生长率的降低和其他生理表型的缺陷。最近的研究发现，核糖体蛋白不仅具有组成核糖体蛋白的功能，还可能参加了其他的生命活动，即具有核糖体外功能。最近的研究表明，真核生物的核糖体蛋白S4（Rps4p）具有潜在的核糖体外功能。在酿酒酵母中，Rps4p与细胞大小，端粒长度，过氧化氢敏感度和硫酸新霉素的敏感度有关。小麦的Rps4p具有半胱氨酸酶活性。而研究也表明，人类的唐氏综合征也可能与Rps4p相关。这些研究结果提示了真核生物的Rps4p具有潜在的核糖体外功能。本课题主要关注了白念珠菌核糖体蛋白S4的功能。在酿酒酵母中，Rps4p由同源基因RPS4A和RPS4B编码。虽然两个基因编码的蛋白质的序列的一致程度相当高，但两个基因却表现出了不同的表型。这些现象为我们研究白念珠菌的Rps4p的功能提供了很好的线索。在白念珠菌中，Rps4p由同源基因RPS41和RPS42编码，长度为262个氨基酸。基因RPS41位于白念珠菌染色体的2号染色体上，全长为789bp,不含有内含子；基因RPS42位于白念珠菌染色体的1号染色体上，全长为1358bp,含有一个长度为569bp的内含子。基因RPS41和RPS42所编码的蛋白仅有一个氨基酸的差异。为了深入研究Rps4p的功能，我们用“Ura-Blaster”基因敲除策略在CAI4菌中分别构建了rps41Δ和rps42Δ基因缺失菌和相应的回复菌。“Ura-blaster”基因敲除策略虽然需要构建重组质粒，具有一定的工作量；营养选择标记URA3对表型也有一定的影响等缺点。但本方法也具有其无可取代的优点。首先，该方法成熟稳定，应用范围广，在技术操作上易于实现。其次，可以在基因敲除片段两端构建较长的目的基因同源序列，增加同源重组过程的特异性，较易获得基因敲除菌株，特别是对较难敲除的基因尤为有效。再次，URA3营养选择标记可以重复利用，可以实现对多拷贝基因的敲除或者同一菌株的多基因敲除，其他基因敲除方法很难实现。本课题中的RPS41和RPS42均具有三拷贝，所以“Ura-blaster”基因敲除策略比较适合本课题。虽然有文献报道，URA3基因的表达量和在染色体的位置对白念珠菌的毒力等表型有所影响，但这些缺点是可以克服的。有文献报道，将URA3插在RP10，ENO1， ARG4等基因位置或者URA3在染色体中的原始位置，这样可在一定程度上消除URA3的影响。本课题统一将URA3营养选择标记回复在RP10的位置，来消除URA3的影响。我们的实验结果表明，RPS41基因的缺失将导致白念珠菌很多方面的功能缺陷。通过生长率测定实验，发现rps41Δ基因缺失菌表现为生长速率显著降低，而rps42Δ基因缺失菌的生长速率与野生菌没有明显的差别。通过测定，rps41Δ基因缺失菌的平均生长率为μ=0.48h-1，rps42Δ基因缺失菌的生长率为μ=0.68h-1，而野生菌CAI4的生长率为μ=0.66h-1。rps41Δ基因缺失菌的生长速率相对于rps42Δ基因缺失菌和野生菌降低了28%左右。为了检测rps41Δ基因缺失菌的被膜形成能力，我们利用扫描电镜来检测成熟生物被膜的结构。结果表明，rps41Δ基因缺失菌的被膜形成较野生菌大量降低。野生菌的生物被膜呈经典的三维结构，主要由菌丝构成。而rps41Δ基因缺失菌的生物被膜的形成受到了抑制，以酵母态和假菌丝态为主，很少看见真菌丝。为了寻求RPS41基因影响生物被膜形成的机制，我们从影响生物被膜形成的各个方面进行了研究。我们首先考察了影响被膜形成的关键因素，菌丝形成能力。利用菌丝形成实验，我们发现rps41Δ基因缺失菌的菌丝形成能力下降，而rps42Δ基因缺失菌的菌丝形成没有受到明显的影响。其次，我们考察了影响生物被膜形成的另一重要因素，抗氧化能力。我们发现rps41Δ基因缺失菌的对过氧化氢的敏感度是升高的，说明了其抗氧化能力的下降。而rps42Δ基因缺失菌与野生菌相比没有显著的变化。再次，，我们利用二维电泳技术分析了野生型菌和rps41Δ基因缺失菌生物被膜状态下的蛋白质组。蛋白质组分析结果表明，rps41Δ基因缺失菌的能量代谢主要以无氧呼吸为主，抗氧化的相关蛋白表达水平上升，表明了其体内的ROS水平较野生菌低，从而表明了其菌丝形成能力是降低的。同时我们也发现菌丝形成相关蛋白也是低表达的。实验结果表明，白念珠菌生物被膜的形成时依赖于Rps4p的。我们还进行了体内毒力实验来检测两个基因缺失菌的毒力。实验结果表明，rps41Δ基因缺失菌的毒力是显著降低的。野生菌和rps42Δ基因缺失菌感染组的小鼠平均生长时间只有4-7天，而rps41Δ基因缺失菌感染组的小鼠平均生长时间却达到16天左右。我们还考察了RPS41和RPS42两个基因的表达水平。结果表明，基因RPS42的缺失对基因RPS41的表达水平影响并不是很明显，而基因RPS41的缺失会强烈的诱导基因RPS42的表达，达到正常水平的20多倍。虽然基因RPS42被强烈的诱导，其所表达的Rps4p的mRNA也只有正常水平的20%.这些结果说明，在正常情况下，主要由基因RPS41表达Rps4p，基因RPS42基本上处于沉默状态。基因RPS41和RPS42的表达水平是不对称的，基因RPS41在白念珠菌的生命活动中比基因RPS42发挥更加关键的作用。RPS41基因的缺失并不是对所有的表型都有影响，rps41Δ基因缺失菌对粘附生长能力的影响不是很显著，对唑类药物敏感度也没有明显的变化。Rps4p的量的降低会影响核糖体的形成，可能会使某些蛋白质的合成受到影响，但是这种影响是特异的，这表明了Rps4p功能的特异性，也揭示了Rps4p潜在的核糖体外功能。最近的研究表明白念珠菌具有交配的能力。参与交配的信号通路和酿酒酵母的是相似的。在白念珠菌中，缺失G蛋白的α亚基和β亚基将会导致白念珠菌完全丧失交配能力。但是G蛋白γ亚基在白念珠菌交配过程中的作用还不是很清楚。为了明确G蛋白γ亚基在白念珠菌交配过程中的作用，本课题对STE18基因的功能进行了研究。在白念珠菌中，基因STE18编码经典的G蛋白的γ亚基，氨基酸长度为90个氨基酸。G蛋白γ亚基的氨基酸序列在裂殖酵母中有很高的保守性，并且C末端含有CAAX盒。我们利用同源重组的原理，构建了ste18Δ基因缺失菌和STE18基因C末端敲除菌。结果表明，G蛋白的γ亚基和γ亚基的C末端在白念珠菌的交配中都是必需的。我们还考察了G蛋白三个亚基之间的关系。结果表明，在ste18Δ基因缺失菌过量表达G蛋白的α亚基或者β亚基可以使白念珠菌在缺少γ亚基的情况下进行交配。这说明Gγ的作用可以被过量的Gα或者Gβ取代。我们的结果揭示了白念珠菌的G蛋白3个亚基之间的相互作用关系与其它菌株相比具有特异性。
[Abstract]:Candida albicans is an important opportunistic pathogen . It can cause a variety of diseases , including mucosal infection and life - threatening systemic diseases . In recent years , the use of long - term catheterization techniques and the use of broad - spectrum antibiotics have contributed to the increasing number of Candida albicans infections .

Ribosomal RNA ( rRNA ) and ribosomal protein ( RP ) . The ribosome protein is an important part of ribosome . The main function of ribosomal protein is to guarantee the smooth progress of protein synthesis .

In Saccharomyces cerevisiae , Rps4 was encoded by homologous genes RPS4A and RPS4B . Although the sequence identity of two genes was quite high , the two genes showed different phenotypes . These phenomena provide a good clue to the function of RPS41 and RPS42 of Candida albicans . The gene RPS41 is located on chromosome 2 of Candida albicans , with a total length of 789bp , which does not contain intron ;
The gene RPS42 is located on chromosome 1 of Candida albicans with a total length of 1358 bp and contains an intron of 569bp in length . The protein encoded by RPS41 and RPS42 has only one amino acid difference .

In order to further study the function of Rps4p , we constructed rps4螖and rps42螖 gene deletion bacteria and corresponding revertants respectively in CA14 by using the " Ura \ " gene knock - out strategy . Although the " Ura \ " gene knock - out strategy needs to construct recombinant plasmid , it has a certain workload ;
in that first part , the method is mature and stable , wide in application range and easy to realize in the technical operation .

The results showed that the deletion of RPS41 gene could result in the functional defects in many aspects of Candida albicans . The growth rate of rps4螖gene deleted bacteria was significantly lower than that of wild bacteria . The growth rate of rps4螖gene deleted bacteria was 渭 = 0.68h -1 , while the growth rate of rps4螖gene deleted bacteria was 渭 = 0.66h - 1.rps4螖gene deletion bacteria decreased by 28 % with respect to rps42螖 gene deletion bacteria and wild bacteria .

In order to detect the formation of rps4螖gene - deleted bacteria , we found that rps4螖gene - deleted bacteria had no significant effect on the formation of membrane . The results showed that the expression of rps4螖gene - deleted bacteria was decreased .

In order to clarify the role of G protein 纬 subunit in the mating of Candida albicans , the effect of G protein 纬 subunit in the mating of Candida albicans is not clear . In order to clarify the role of G protein 纬 subunit in the mating process of Candida albicans , we also studied the relationship between G protein 纬 subunit and C terminal of STE18 gene .

【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R519.3

【参考文献】