丙型肝炎病毒核心蛋白抑制Wnt信号通路拮抗因子SFRP1的分子机制

发布时间：2018-05-28 03:21

  本文选题：丙型肝炎病毒核心蛋白 + SFRP1　； 参考：《重庆医科大学》2013年硕士论文

【摘要】：目的：原发性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是人类最常见的致死性恶性肿瘤之一，丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）感染是引发HCC的重要危险因素。全球已有约2亿人感染HCV，约占世界总人口的3%，每年新增病例300万～400万。目前HCV抗病毒治疗主要采用聚乙二醇干扰素联合利巴韦林，但这种治疗手段对高滴度HCV RNA和血清型为HCVⅠ型的患者效果并不理想。HCV感染严重危害人们的身体健康，因此深入研究HCV感染相关HCC的致病机理将为防治HCV感染疾病提供新的防治策略。核心蛋白是HCV病毒编码产生的分子量为21kDa的多功能结构蛋白。研究表明：核心蛋白参与丙型肝炎病毒的组装、释放，并与细胞内重要的一些转录因子或者多种信号通路相互作用，削弱机体的免疫防御功能，进而引起HCV相关肝硬化甚至肝癌的发生；HCV核心蛋白还能与p53、p73、pRb等抑癌基因直接结合，抑制细胞的凋亡，导致肿瘤的发生。 Wnt/β-catenin信号通路的异常激活在肝癌的发生中至关重要，目前研究表明它的异常激活至少与50%以上的HCC发生相关。HCC临床标本中，AXIN基因突变比较少见，由β-catenin基因突变引起β-catenin的活化仅占20%，结肠腺瘤样息肉基因（AdenomatousPolyposis Coli，APC）的失活突变仍未在HCC中发现，这表明在HCC发生过程中，Wnt/β-catenin信号通路的拮抗分子如SFRPs的失活可能参与了该信号通路的异常活化。 DNA甲基化修饰是表观遗传调控的重要方式，研究证实，肺癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、肝癌等众多实体肿瘤中均存在SFRPs启动子区高度甲基化修饰。已有研究表明病毒感染机体后能够以表观遗传修饰的方式调控基因的转录和表达，引起细胞的异常分化、增殖，导致相关疾病的发生。HCV核心蛋白能否通过甲基化、乙酰化、或组蛋白修饰等表观遗传水平调控SFRPs基因的表达，目前还未见研究报道。本课题组前期实验已经证实HCV核心蛋白能够下调SFRP1的表达，，本研究旨在进一步深入探讨核心蛋白调控SFRP1的分子机制；并从正反两方面验证表观遗传对肿瘤细胞生物学行为的影响。 方法：本课题组前期实验已经证实丙型肝炎病毒核心蛋白能够下调SFRP1的表达，并且SFRP1的表达经DAC处理后能够部分恢复。本实验在前期实验的基础上，进一步采用基因重组技术构建SFRP1启动子区截短报告质粒，确定启动子区活性最强区域，并探讨HCV核心蛋白对SFRP1启动子活性的影响；通过染色质免疫共沉淀技术（Chromatin immunoprecipitation, ChIP）研究核心蛋白对SFRP1基因表观沉默的分子作用机制。此外，通过平板克隆形成实验、结晶紫染色、肿瘤细胞迁移实验、侵袭实验和肝癌裸鼠移植瘤模型系统研究HCV核心蛋白对细胞生物学行为的影响。进一步采用亚重硫酸盐DNA测序方法验证核心蛋白是否可以促进裸鼠移植瘤细胞中SFRP1启动子区高甲基化修饰，用免疫组化方法检测裸鼠移植瘤中PCNA、 β-catenin及Wnt下游靶基因c-Myc以及MMP2、MMP9的表达。 结果：本实验利用基因重组技术成功构建了SFRP1启动子区截短报告质粒，通过双荧光素酶活性检测方法确定SFRP1启动子区活性最强区域为-407～-27nt，并且证实HCV核心蛋白能够抑制SFRP1启动子区的活性。ChIP结果显示：在过表达核心蛋白的Huh7及SK-Hep1细胞中，核心蛋白可增强Dnmt1、HDAC1及甲基化结合蛋白MBD1，MBD2，MeCP2富集于SFRP1的启动子区，抑制乙酰化组蛋白H3、组蛋白乙酰化转移酶P300结合于SFRP1启动子区。平板克隆形成实验和结晶紫实验均证实，在稳定表达HCV核心蛋白的肝癌细胞系中，核心蛋白促进肝癌细胞增殖，沉默Dnmt1和（或）回复SFRP1能够抑制这种作用。迁移以及侵袭实验表明，HCV核心蛋白增强肝癌细胞系Huh7及SK-Hep1细胞迁移及侵袭能力，同样，沉默Dnmt1和（或）回复表达SFRP1能够抑制这种作用。体内实验研究表明沉默Dnmt1和（或）回复表达SFRP1能够抑制裸鼠皮下移植瘤的生长，下调β-catenin和Wnt下游靶基因的表达。同时也证明，沉默Dnmt1和（或）回复SFRP1能够抑制MMP2、MMP9的表达。 结论：HCV核心蛋白可通过增强Dnmt1，HDAC1及甲基化相关蛋白MBD1、MBD2、MeCP2富集于SFRP1启动子区，诱导其甲基化，抑制其启动子区活性，导致SFRP1基因表达沉默。体外及体内实验证实HCV核心蛋白通过下调Wnt/β-catenin信号通路抑制分子SFRP1的表达，诱导Wnt信号通路活化，最终参与HCV相关肝癌的发生。
[Abstract]:Objective : Primary hepatic carcinoma ( HCC ) is one of the most common fatal malignant tumors in the world . Hepatitis C virus ( HCV ) infection is an important risk factor for HCV infection .
HCV core protein can bind to p53 , p73 , pRb and other tumor suppressor genes directly , inhibit the apoptosis of cells , and lead to the occurrence of tumor .

The abnormal activation of Wnt / 尾 - catenin signaling pathway is very important in the genesis of HCC . In the present study , it is shown that the abnormal activation of Wnt / 尾 - catenin signaling pathway is associated with more than 50 % HCC . In HCC clinical specimens , the inactivation of 尾 - catenin is only 20 % in HCC clinical specimens , and the inactivation mutation of adenomatous Polyposis Coli ( APC ) is still not found in HCC . This suggests that the inactivation of Wnt / 尾 - catenin signaling pathway , such as SFRPs , may be involved in abnormal activation of the signal pathway .

DNA methylation modification is an important way of epigenetic regulation . It has been proved that SFRPs promoter region is highly methylated in many solid tumors such as lung cancer , breast cancer , bladder cancer , gastric cancer , colon cancer and liver cancer .
The effect of apparent inheritance on the biological behavior of tumor cells was verified from the positive and negative sides .

Methods : The core protein of the hepatitis C virus was confirmed to be able to downregulate the expression of SFP1 , and the expression of SFP1 could be partially recovered after DAC treatment . The experiment was carried out on the basis of the previous experiment , and further adopted the gene recombination technique to construct the short report plasmid of the promoter region of the SF1gene , determine the most active region of the promoter region , and probe into the influence of the HCV core protein on the activity of the SFP1 promoter .
The effect of core protein on the apparent silencing of SFP1 gene was studied by means of chromatin immunocodeposition ( CHIP ) . In addition , the expression of PCNA , 尾 - catenin and Wnt downstream target genes c - Myc , and MMP2 and MMP 9 were detected by immunohistochemical method .

Results : In this experiment , we have successfully constructed the truncated reporter plasmid of SF1promoter region by using gene recombination technique , and confirmed that the activity of the promoter region is -407 锝

本文编号：1945046