慢性HBV感染引起NK细胞功能受损的分子机制研究
发布时间：2019-07-11 09:56
【摘要】：研究背景乙肝病毒(HBV)感染是威胁人类健康的最严重的疾病之一。大量研究表明,在慢性HBV(CHB)感染过程中,机体固有免疫和获得性免疫应答不足是造成HBV持续感染、肝脏损伤加重,乃至HBV慢性化和迁延不愈的重要原因,并且HBV感染可引起免疫细胞的功能发生改变。NK细胞是天然免疫系统中的重要效应细胞,在HBV感染早期可从外周募集至肝脏,进而发挥抗病毒作用。但是,在慢性HBV感染中,NK细胞表现为功能抑制状态,比如细胞毒活性降低,抗病毒分子IFN-γ的分泌受阻等。尽管有学者将NK细胞功能受损的机制归咎于其它免疫细胞(如Treg)和免疫负调因子(如TGF-β,IL-10)等的调节作用,但是其确切机制目前还不十分清楚,尚需进一步研究。HBV病毒虽然是嗜肝DNA病毒,但也会侵犯肝脏之外的其它器官和组织,并引起相关部位的疾病。其中,外周血单个核细胞(PBMC)一直被认为是HBV病毒的“肝外储存库”,这不仅是肝脏移植后感染HBV的重要原因,而且与隐性HBV感染、围产期母婴传播、病情的轻重和反复相关。2006年有研究发现,虽然树突状细胞(DC)不支持HBV病毒在其细胞内的复制,但是在乙肝患者的DC中检测到了HBV基因成分。此后的研究也发现,与HBV病毒颗粒或抗原孵育后,DC的表型和应答能力显著受到抑制。那么,在慢性HBV感染的病人中,HBV病毒成分能否通过某些途径侵入外周血的NK细胞,以及NK细胞功能受损与HBV病毒是否有直接的关系,这些问题目前还未见研究报道。研究表明,HBV病毒成分(HBsAg、HBeAg、HBx、HBV聚合酶、DNA及其转录中间体等)可通过影响固有模式识别系统(如TLRs,RLRs),进而影响肝细胞或者免疫细胞的应答能力。例如,HBsAg能下调粒细胞／巨噬细胞中TLR2配体诱导的IL-12的表达。那么,NK细胞同样表达大量的固有模式识别受体,HBV成分是否也会通过模式识别受体直接影响NK细胞的应答能力,以及影响NK细胞重要的信号通路?另外,“胞外体(exosomes)"的研究近年来引起了病毒学界的关注,它可以介导某些病毒在细胞之间进行传递。那么,胞外体(exosomes)能否介导HBV病毒侵入NK细胞?基于上述问题,我们开展了关于慢性HBV感染引起NK细胞功能受损的分子机制研究。研究目的论文首先利用分子生物学、细胞生物学等手段,验证了CHB患者外周血NK细胞中确实存在HBV病毒成分；然后,详细分析了HBV病毒成分(HBV抗原、HBV基因)对NK细胞生物学活性和功能的影响,并探讨了其发挥作用的分子机制；最后,从慢性HBV感染患者的血清中分离获取了胞外体,并证实胞外体可将其携带的HBV病毒成分传递到NK细胞中,进而影响NK细胞的功能。论文不仅为HBV存在肝外感染提供有利的证据,还探讨了HBV感染使NK细胞功能受损的分子机制和途径。论文的研究结果扩展了我们对HBV病毒干预免疫系统的认识,还将为HBV诊断、治疗和预防提供了新的切入点。研究方法1.我们首先从临床收集了CHB患者的外周血,分离其外周血单个核细胞,并用磁珠分选了NK细胞。采用普通PCR,探针定量PCR以及ELISA方法进一步验证CHB患者的血清、PBMC以及外周血NK细胞中是否存在HBV病毒成分,包括HBV DNA(rcDNA和cccDNA)和蛋白成分(HBsAg和]HBeAg),通过透射电镜观察慢性HBV患者的外周血NK细胞中是否存在病毒颗粒。随后,采用MTT法检测临床标本的PBMC对人白血病细胞系K562的杀伤比率,并采用Spearman秩相关分析,分析了NK细胞杀伤比率与血清HBV载量、与PBMC中HBV载量、以及与血清中抗原含量之间的线性关系。采用ELISA方法检测CHB患者血清中细胞因子TGF-β的含量。2.将表达HBV全基因组的载体以电穿孔的方法转入NK细胞系NK-92,经嘌呤霉素筛选建立稳定表达的细胞株,研究HBV基因对NK细胞的影响。此外,HBV抗原(HBsAg和HBeAg)与NK-92细胞共孵育,用于检测HBV抗原对NK细胞的影响。与此同时,我们还收集了临床样本,将CHB患者的外周血NK细胞与NK-92细胞系的结果进行对比分析。分别用MTT法和CFSE细胞增殖示踪检测试剂盒检测了NK细胞的增殖能力,Annixin V/PI凋亡检测试剂盒分析了HBV基因和抗原对NK细胞凋亡的影响,NK细胞周期则采用PI周期检测试剂盒进行测定。通过RT-PCR和流式细胞术的方法检测NK细胞受体(NKG2D,NKG2A等),杀伤相关分子(IFN-γ,TNF-α等)和模式识别受体(TLR3,RIG-I)的基因和蛋白表达水平的变化。以肝癌细胞HepG2和白血病细胞K562为靶细胞,用CFSE/7AAD流式细胞术检测NK细胞的杀伤水平。采用流式检测术分析了代表NK细胞脱颗粒能力的CD107a分子的表达水平。通过Western blot和流式细胞术方法分析NK细胞信号传递的蛋白NF-kB (p65)、MAPK(ERK1/2, c-jun, JNK,p38)以及STATs信号通路的活化水平。3.我们分别利用胞外体提取试剂盒和超速离心的方法提取CHB患者血清中的胞外体。通过透射电镜观察胞外体的形态。采用普通PCR的方法,检测胞外体中HBV基因成分,并采用ELISA方法检测胞外体中HBsAg、HBeAg和HBsAb的含量。最后,我们将CHB血清来源的胞外体与健康志愿者的外周血NK细胞共孵育,进而观察HBV病毒成分能否进入NK细胞,并采用流式检测术检测CHB血清来源的胞外体对NK细胞的脱颗粒水平CD107a和IFN-γ的分泌水平的影响。结果一、CHB患者外周血NK细胞功能受到显著抑制1.CHB患者的外周血PBMC细胞杀伤功能抑制与健康志愿者相比,CHB患者来源的PBMC细胞杀伤效率明显降低。与此同时,CHB患者血清中TGF-β含量明显高于健康志愿者,说明慢性HBV感染患者的PBMC细胞活性与免疫负调因子TGF-p相关。2.CHB患者的外周血淋巴细胞亚群分布检测PBMC的细胞分群发现,CHB患者外周血中NK细胞和T细胞比例明显下降,而NKT细胞比例没有统计学差异。3.CHB外周血NK细胞的增殖与存活能力的变化利用磁珠分选柱(MASC)分选纯化出NK细胞检测其细胞生物学活性,包括增殖、周期和凋亡。与健康志愿者相比,CHB患者来源的NK细胞增殖水平明显降低；NK细胞的S期比例升高,G2期比例降低；在血清饥饿培养的条件下,NK细胞凋亡水平明显升高。说明在慢性HBV感染时,外周血NK细胞生物学活性发生了改变。4.CHB患者外周血NK细胞的功能受到抑制分离健康志愿者和CHB患者的PBMC,分析了CD56+CD3-NK细胞CD107a脱颗粒水平和分泌抗病毒分子IFN-y的能力。结果显示,CHB患者NK细胞CD107a的表达水平和IFN-y的分泌水平均明显低于健康志愿者。5.CHB患者外周血NK细胞的受体发生改变我们检测了CHB患者外周血NK细胞的活化性受体NKG2D、NKp30、 NKp44、NKp46和2B4,以及抑制性受体NKG2A的变化。结果显示,CHB来源的NK细胞中,活化性受体NKp30和2B4显著性降低,其它活化性受体NKG2D、NKp44和NKp46以及抑制性受体NKG2A的表达在CHB患者和健康志愿者之间没有明显的差异性。二、CHB患者PBMC和外周血NK细胞中存在HBV病毒成分1.CHB患者PBMC细胞中存在HBV病毒成分提取CHB患者PBMC的基因组DNA,普通PCR扩增HBV-rcDNA和HBV-cccDNA,结果证实CHB患者PBMC存在HBV DNA。探针PCR检测CHB患者血清中的HBV的载量和PBMC中的HBV的载量,采用Spearman秩相关分析,发现两者存在较好的正相关性(r=0.644,p0.01)。MTT法检测CHB患者PBMC对K562细胞的杀伤率,并比较其和病毒载量之间的线性关系,结果显示两者之间存在较好的负相关性(r=-0.5868,p0.05)。此外,我们还分析了PBMC的杀伤率与血清抗原含量之间的线性关系,发现两者之间并不存在线性关系。2.CHB患者外周血NK细胞中存在HBV病毒成分利用MACS分选CHB患者PBMC中的NK细胞,采用普通PCR和探针PCR方法检测到CHB患者来源的NK细胞中存在HBV DNA,并且我们通过透射电镜观察到NK细胞的胞浆中存在HBV病毒的包涵体。三、HBV基因/抗原对NK细胞生物学功能的影响1.HBV基因对NK细胞生物学功能的影响1.1 HBV过表达细胞株的建立和鉴定我们通过电穿孔的方法将含GFP标签的对照质粒LMP和HBV过表达质粒LMP-HBV1.2转入NK-92细胞系,筛选建立稳定过表达细胞株,将其分别命名为NK-92-LMP和NK-92-HBV。PCR结果表明,NK-92-HBV细胞中可以检测到HBV-rcDNA、HBx、HBs/p以及HBc基因,但是其培养上清和细胞裂解液中均未检测到HBsAg和HBeAgo1.2 HBV基因对NK细胞生物学活性的影响与转染对照质粒组NK-92-LMP细胞相比,MTT法检测到NK-92-HBV细胞的增殖率明显降低,流式细胞术显示NK-92-HBV细胞被阻滞在G1期。低浓度血清饥饿培养条件下,与NK-92-LMP细胞相比,NK-92-HBV细胞的凋亡比例明显增加,说明HBV基因会影响NK细胞的存活和基础代谢。1.3 HBV基因抑制NK-92细胞的杀伤活性与NK-92-LMP细胞相比,表达HBV的NK-92细胞对K562和HepG2细胞的杀伤能力显著降低,反应脱颗粒能力的CD107a阳性细胞比例也明显下降,说明HBV的基因可影响NK细胞的杀伤功能。1.4 HBV基因抑制NK-92细胞的杀伤和炎症相关分子的表达与NK-92-LMP细胞相比,PCR结果显示,表达HBV的NK-92细胞,抗病毒分子IFN-γ和TNF-a以及杀伤相关分子perforin的转录水平均显著降低；流式细胞术结果证实,NK-92-HBV细胞中IFN-γ和perforin的蛋白表达明显受到抑制。1.5 HBV基因改变NK-92细胞受体的表达与空载体NK-92-LMP细胞相比,NK-92-HBV细胞中活化性受体NKp30、 NKp44和2B4受体的表达降低,NKG2D的变化无统计学差异；而抑制性性受体NKG2A表达显著升高。2.HBV抗原对NK细胞生物学功能的影响2.1 HBsAg和HBeAg的浓度测定透射电镜观察HBV抗原(HBsAg和HBeAg)的形态,采用ELISA试剂盒,对的浓度进行测定。将HBsAg和HBeAg进行倍比稀释,稀释至0.5 μg/mL备用。2.2 HBV抗原对NK细胞生物活性的影响将不同浓度的HBsAg和HBeAg (2μg/mL、4μg/mL和20 μg/mL)与NK-92细胞进行共孵育,继而检测NK-92细胞的增殖、周期和凋亡。结果显示,与BSA对照组相比,HBsAg和HBeAg对NK细胞的增殖和凋亡均无显著性影响。但是,高浓度(20μg/mL)的HBsAg使NK-92细胞的S期比例略有上升,G2期比例略下降。这说明,与HBV基因的影响相比,HBV抗原对NK细胞的存活和基础代谢的影响较弱。2.3 HBV抗原抑制NK-92细胞的杀伤活性与BSA对照组相比,HBsAg和HBeAg抗原孵育后的NK-92细胞对K562和HepG2细胞的杀伤能力显著降低,反应脱颗粒能力的CD107a阳性比例也明显下降,说明HBsAg和HBeAg均可影响NK细胞的杀伤功能。2.4 HBV抗原对NK-92细胞的杀伤和炎症相关分子的表达无显著影响HBV抗原孵育NK-92细胞后,我们用流式细胞术检测了其胞内抗病毒分子IFN-y和TNF-a以及杀伤相关分子perforin和GramB的表达。结果显示,与BSA组相比,经抗原孵育的NK-92细胞分泌IFN-γ、TNF-α、perforin和GramB的能力没有受到明显的影响。2.5 HBV抗原改变NK-92细胞的受体的表达HBV抗原孵育NK-92细胞后,我们流式细胞术检测了其表面活化性受体和抑制性受体的变化。结果显示,HBV抗原孵育后,NK-92细胞活化性受体NKp30和NKp44阳性比例下降,2B4比例虽无显著性差异,但其平均荧光强度显著降低；而抑制性受体NKG2A的阳性比例升高。此外,我们利用磁珠分选了健康志愿者的外周血NK细胞,加入HBsAg和HBeAg进行孵育(2 μg/mL)。结果显示,与BSA处理组相比,HBeAg孵育后,外周血NK细胞仅NKG2D阳性比例显著下降,其它受体均没有显著性变化。四、HBV基因/抗原可以影响NK细胞对免疫刺激的应答1.HBV基因航原可抑制NK细胞对PMA/Ionomycin的应答经PMA/Ionomycin刺激后,与NK-92-LMP细胞相比,NK-92-HBV细胞分泌IFN-y和GramB的水平显著降低,而perforin和TNF-a的表达未受到显著影响。经PMA/Ionomycin刺激后,与BSA组相比,HBsAg和HBeAg孵育后的NK-92细胞分泌IFN-γ和TNF-a的水平显著下降,而perforin和GranB的表达无显著差异。2.HBV基因/抗原可以抑制NK细胞对poly I:C的应答流式细胞术的结果显示,经poly I:C刺激后,与NK-92-LMP细胞相比,NK-92-HBV细胞分泌IFN-γ、perforin和GramB的水平显著降低；而TNF-a的表达未受到显著影响。流式细胞术的结果显示,经poly I:C刺激后,与BSA组相比,HBsAg和HBeAg孵育后的NK-92细胞分泌GramB的水平显著降低,而IFN-γ、TNF-a和perforin的表达无显著差异。此外,还检测了NK细胞脱颗粒水平CD107a的表达。结果显示,经poly I:C刺激后,NK-92-HBV细胞CD107a的表达上调,但仍低于NK-92-LMP细胞。同样的,经poly I：C刺激后,与BSA组相比,HBsAg可以显著抑制NK-92细胞中CD107a的表达。五、HBV对NK细胞模式识别受体信号通路的影响1.HBV对NK细胞模式识别受体表达水平的影响PCR和流式细胞术实验结果证明,与NK-92-LMP细胞相比,NK-92-HBV细胞中TLR3和RIG-I的mRNA水平、蛋白表达均受到了显著抑制。PCR和western blotting实验结果显示,与BSA组相比,HBsAg和HBeAg孵育后,NK-92细胞中RIG-1的]mRNA水平和蛋白表达明显下降。流式细胞术结果证实,CHB患者的外周血NK细胞中RIG-I受体表达明显低于健康志愿者。最后,在NK-92-HBV细胞中过表达RIG-I,能逆转HBV对NK细胞的抑制作用,即细胞的杀伤活性、IFN-7和D107a的表达均得到恢复。以上结果提示,CHB患者的外周NK细胞中RIG-I通路在HBV感染后可能受到抑制。2.HBV影响NK细胞中的NF-kB和p38-MAPK信号通路未经刺激或经poly I:C刺激的条件下,与NK-92-LMP细胞相比,NK-92-HBV细胞中,NF-kB (p65)的磷酸化水平明显下降；MAPK通路中p38的磷酸化水平也明显受到了抑制,而ERK、JNK和c-Jun活化水平未受到影响。同样的,我们还观察到,未经刺激或经poly I:C刺激的条件下,与BSA组相比,HBsAg和HBeAg孵育后的NK-92细胞中NF-kB (p65)和p38信号通路也存在同样的趋势。进一步,我们采用流式细胞术检测了CHB患者外周血NK细胞中的NF-kB和p38的磷酸化表达水平,结果显示,与健康志愿者相比,CHB患者外周血NK细胞中的NF-kB和p38的磷酸化水平明显降低。3.HBV对NK细胞STATs通路的影响PCR和Western blotting实验结果显示,与对照组NK-92-LMP细胞相比,NK-92-HBV细胞中STAT1及STAT3的mRNA转录水平和蛋白水平均显著下降。与之相似,HBsAg和HBeAg孵育后的NK-92细胞中STAT1的mRNA转录水平和蛋白水平受到了显著抑制,但是STAT3的转录水平和蛋白水平无显著性变化。六、HBV病毒通过胞外体(exosomes)进入NK细胞1.CHB患者血清中胞外体的分离提取我们提取了CHB患者血清中胞外体,通过透射电镜观察到,CHB患者血清来源的胞外体的直径介于50-100nm之间,大小不均,是具有典型脂质双分子层结构的小囊泡,呈现圆形或椭圆形。并且,我们还观察到的～22nm左右的HBsAg。2.CHB患者血清的胞外体中检测到HBV病毒成分普通PCR的方法显示,CHB患者血清来源的胞外体中含有HBV-rcDNA和HBV-cccDNA;而ELISA实验证实,CHB患者血清的胞外体中含有HBsAg和HBeAg。3.CHB患者血清的胞外体可以介导HBV进入NK细胞CHB患者血清来源的胞外体与健康志愿者外周血NK细胞共孵育,PCR方法证实孵育后的NK细胞中存在HBV-DNA,说明胞外体可能是HBV病毒进入免疫细胞的有效途径。4.CHB患者血清的胞外体对NK细胞功能的影响CHB患者血清的胞外体与健康志愿者外周血NK细胞共孵育,流式细胞术结果证实,孵育后的NK细胞分泌CD107a和IFN-γ的水平均受到显著抑制。七、细胞因子可逆转HBV对NK细胞功能的抑制作用IL-2、IL-12、IL-15以及IFN-α是四种常用的NK细胞活化因子。我们将不同浓度的IL-2、IL-12、IL-15以及IFN-α与NK-92-HBV细胞共孵育,进而检测了NK-92细胞脱颗粒水平CD107a的表达和分泌细胞因子IFN-γ的水平。结果显示,低浓度的细胞活化因子刺激后,NK-92-HBV细胞的CD107a和IFN-γ的分泌水平显著低于与NK-92-LMP细胞。高浓度的细胞活化因子刺激后,NK-92-HBV细胞的CD107a和IFN-γ的分泌水平显著升高,与NK-92-LMP细胞大致相当。这说明高浓度的IL-2、IL-12、IL-15以及IFN-α均逆转HBV对NK细胞的抑制作用。研究意义：1.进一步证实CHB患者外周血NK细胞中存在HBV病毒成分,为HBV的肝外感染提供了依据。2.从CHB患者血清中分离获得胞外体(exosomes),证明其中含有HBV病毒成分,且胞外体可能是HBV进入NK细胞的有效途径。3.系统分析了HBV抗原和HBV基因对NK细胞功能的影响,发现HBV成分不仅可抑制NK细胞的细胞毒活性,而且还可以抑制NK细胞的中重要的固有免疫通路,即RIG-I下游的NK-κB和p38-MAPK信号通路。4.此项研究成果扩展了我们对HBV病毒直接干预免疫系统的认识,为逆转NK细胞功能状态,以及临床HBV治疗提供了新的切入点。
文内图片：
图片说明： 于嗜肝性ＤＮＡ病毒科，其基因组是从感染者血清中经过克隆、测序进行鉴定的。逡逑１．邋ＨＢＶ病毒逡逑完整的ＨＢＶ病毒是具有双层衣壳结构的球形颗粒（图１），，又称Ｄａｎｅ颗粒，逡逑直径４２ｎｍ。病毒外层结构是脂蛋白包膜，内层结构为核衣壳，核衣X蚰谑遣《惧义匣蜃楹途酆厦缚冢荨ｅ义希欤
本文编号：2513066
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图片说明： 于嗜肝性ＤＮＡ病毒科，其基因组是从感染者血清中经过克隆、测序进行鉴定的。逡逑１．邋ＨＢＶ病毒逡逑完整的ＨＢＶ病毒是具有双层衣壳结构的球形颗粒（图１），，又称Ｄａｎｅ颗粒，逡逑直径４２ｎｍ。病毒外层结构是脂蛋白包膜，内层结构为核衣壳，核衣X蚰谑遣《惧义匣蜃楹途酆厦缚冢荨ｅ义希欤
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