结核分支杆菌感染过程中IL-32ε介导细胞凋亡及抗菌机制的研究

发布时间：2020-04-02 14:59

【摘要】：结核病是一种由结核分支杆菌引起的人畜共患传染病,能够引起大范围感染、畸形甚至死亡。自2015年起,结核病超越艾滋病毒感染成为全球感染死亡的主要原因,每年均导致上百万人死亡和巨大的经济损失。由于缺乏有效的治疗方案,以及各种耐药菌种的出现,结核病的预防和治疗仍是当今世界面临的主要难题之一。巨噬细胞是对抗入侵病菌的第一道防线,它能够吞噬病菌,启动炎症反应,指导适应性免疫细胞,最终清除病菌、消除炎症、恢复体内平衡。然而,结核分支杆菌作为一个强大的胞内寄生菌,在与宿主细胞的长期对抗中,进化出各种策略来躲避宿主的防御机制,并在巨噬细胞中建立合适的条件进行生存和扩散,将巨噬细胞作为其自然栖息地和在宿主中传播的工具。因此,深入了解结核分支杆菌在巨噬细胞中引起的免疫反应以及其逃避机制,对于开发有效的疫苗和针对持续性细胞内感染的靶向免疫治疗具有重要意义。越来越多的证据表明,促炎性细胞因子IL-32在宿主对结核分支杆菌等病原体的防御中发挥着重要作用。由于选择性剪接,IL-32存在多种剪接异构体,可发挥不同的生物学功能。其中,IL-32γ可通过诱导细胞凋亡,激活维生素D抗菌通路等机制抑制细胞中结核分支杆菌的增殖。然而其他剪接异构体对结核分支杆菌感染的影响还鲜有研究。因此,本研究深入探讨了结核分支杆菌感染时巨噬细胞中IL-32对细菌增殖的影响,并描述了IL-32ε诱发抗菌效应和细胞凋亡的潜在机制。主要研究内容及结果如下:1.本研究对结核分支杆菌感染前后巨噬细胞中IL-32不同剪接异构体表达量变化进行了检测。结果显示,结核分支杆菌感染后,巨噬细胞中IL-32多种剪接异构体均有表达,然而表达水平差异显著,其中攻菌后IL-32γ表达量最高,IL-32ε在攻菌前后表达量变化最大。2.由于结核分支杆菌能够诱导IL-32多种剪接异构体不同程度的表达,因此本研究进一步对这些剪接异构体的抗结核作用进行了探索。结果显示,IL-32不同剪接异构体对巨噬细胞中结核分支杆菌增殖的影响不同。其中,IL-32γ和IL-32ε实验全程均显示出显著的抗菌效果,IL-32β和IL-32δ于检测的后半段对细菌的增殖也有不同程度的抑制,而IL-32α和IL-32ζ的抗菌效果并不显著。3.鉴于细胞凋亡是IL-32抵抗结核分支杆菌感染的有效途径,因此本研究进一步探究了IL-32不同剪接异构体对细胞凋亡的影响。结果显示,IL-32不同剪接异构体对巨噬细胞凋亡的诱导能力存在差异。IL-32β、IL-32γ和IL-32ε对细胞凋亡率的上调极为显著,IL-32δ仅微弱提高细胞凋亡率,而IL-32α和IL-32ζ对细胞凋亡没有影响。进一步研究发现,区别于IL-32β和IL-32γ对Caspase-3的高活化率,IL-32ε过表达细胞中并未检测到Caspase-3的激活。并且凋亡相关基因定量结果显示,在IL-32ε过表达细胞中仅有Caspase-6和c-Myc表达上调。因此,本研究认为IL-32ε通过不依赖于Caspase-3的机制诱导细胞凋亡。4.为了进一步探究IL-32ε介导细胞凋亡的信号通路,本研究着重对IL-32ε与Nmi和β-catenin之间的相互联系进行了分析。结果显示,IL-32ε能够诱导巨噬细胞中Nmi的表达。并且,利用siRNA敲降Nmi,能够废除IL-32ε介导的抗菌效应和细胞凋亡。此外,IL-32ε过表达细胞中β-catenin蛋白水平显著降低,在IL-32ε过表达细胞中补充β-catenin也能够抑制IL-32ε介导的细胞凋亡。因此,本研究表明,IL-32ε通过上调Nmi表达,降低细胞内β-catenin蛋白水平,引起细胞凋亡。5.为了探究IL-32ε诱导Nmi表达上调的机制,本研究通过双荧光素酶报告分析逐步筛选出Nmi启动子中应答IL-32ε诱导的核心区域,并深入研究找到了调控IL-32ε诱导Nmi转录的关键转录因子Pax6和CP2。此外,本研究还发现,p38 MAPK在这一过程中起到桥梁作用,即IL-32ε通过激活p38 MAPK信号通路上调Pax6和CP2的转录活性,进而上调Nmi表达水平,明确了IL-32ε诱导Nmi表达的机制。综上所述,在巨噬细胞中,结核分支杆菌能够诱导多种IL-32剪接异构体的表达,且不同剪接异构体的抗菌能力存在差异。其中,结核分支杆菌诱导IL-32ε表达,导致p38 MAPK信号通路激活以及转录因子Pax6和CP2活化,促进了细胞中Nmi的表达。随后,Nmi的上调使细胞中β-catenin蛋白水平下降,最终导致了依赖于Caspase-6和c-Myc的细胞凋亡。这一机制在巨噬细胞抵抗结核分支杆菌感染的过程中发挥着重要作用,可能为结核病的预防及治疗提供了新的靶标。
【图文】：

结核分支杆菌,增殖过程

3图 1-1 结核分支杆菌在体内的增殖过程(Russell et al., 2010)。Fig.1-1 The proliferation of Mycobacterium tuberculosis in vivo.1.1.4 结核病的治疗与诊断活动性结核病患者通常会出现肺部或全身症状，包括咳嗽、胸痛、疲劳和无意识的体重减轻。然而结核分支杆菌能够长期潜伏于有机体，大约 90%的感染以潜伏状态存在(Zumla, 2013)。因此，临床诊断的进展对控制疾病的传播至关重要。潜伏感染通常通过纯化蛋白衍生物试验或 IFN 释放分析进行检测(Al-Orainey, 2009)。而在活动性感染中，建议采用胸片以及三份痰标本的耐酸染色和培养进行分析诊断(Dheda et al., 2016)。此外，疾病控制与预防中心建议对所有考虑诊断为结核分支杆菌感染的个体进行呼吸道标本的核酸扩增。并且，如果临床对感染的怀疑度很高，甚至在阳性检测结果出来

结核分支杆菌,毒力因子,免疫逃逸,宿主防御

第一章文献综述et al., 2012)。这个过程称为胞葬，对炎症的解决至关重要(Weiss and Schaible, 2015)。通过胞葬吞噬的含有结核分支杆菌的吞噬体随后与溶酶体融合，导致了细菌更大范围的降解(Martin et al., 2012)。细胞凋亡抗结核的机制是，将结核分支杆菌隔离在凋亡细胞中，阻止了细菌不可控的传播，并抑制其毒力因子干扰吞噬体成熟。巨噬细胞作为机体抗菌免疫应答的中心，在抵抗结核分支杆菌感染和控制结核病进程中发挥着不可或缺的作用。事实上，，在与宿主细胞长期的对抗中，结核分支杆菌进化出一系列的策略来抵消宿主免疫应答带来的抗菌效果（图 1-2），从而成功地在巨噬细胞中建立长期生存的空间(Jayachandran et al., 2013)。这个对抗是长期存在的，并且由于耐药菌株尤其是多重耐药（MDR）和广谱耐药（XDR）菌株的出现而变得更为复杂(Guirado et al., 2013; Warner and Mizrahi, 2013)。因此，明确了解特定病原体引起的宿主免疫反应以及病原体的逃避机制，对于开发有效的疫苗和针对持续性细胞内感染的靶向免疫治疗具有重要意义。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R52

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