体外抗烟曲霉生物膜效应与机制及MicroRNA-146a对烟曲霉诱导巨噬细胞固有免疫调控机制的初步研究

发布时间：2020-04-09 13:39

【摘要】：烟曲霉是曲霉感染的最常见致病菌,烟曲霉生物膜的形成是其致病的重要毒力因素之一。巨噬细胞能够有效识别并清除入侵的烟曲霉。本文主要探讨了体外抗烟曲霉生物膜效应与机制及MicroRNA-146a对烟曲霉诱导THP-1巨噬样细胞固有免疫反应的调控作用机制。第一章主要探讨可耐受热效应对烟曲霉生物膜抑制作用的相关机制。我们前期在体外构建烟曲霉生物膜发现热效应作用于烟曲霉生物膜生长过程时,菌丝的极性生长及生物膜的形成均受到抑制。菌丝的极性生长破坏程度与温度呈正相关,温度越高,烟曲霉生物膜的三维结构越松散,生物膜形成的量越少,活力也越差。为进一步探究热效应对烟曲霉生物膜的极性生长的影响,我们利用乙醇脱氢酶启动子-融合PCR技术构建CaM-RFP烟曲霉菌株,在荧光显微镜下观察不同温度作用于烟曲霉时,CaM在菌丝极性生长过程中的动态分布情况,在正常温度培养时,发现红色荧光标记的CaM主要集中在孢子萌芽的一端。随着菌丝的逐渐延长,CaM一直定位在菌丝生长的顶端。当菌丝顶端之外出现红色荧光的点时,提示在该点会有新的分枝出现。在热效应作用下芽体顶端CaM弥散分布于菌丝顶端及其下方,推测菌丝出现过多的分枝及不能很好的维持菌丝的极性生长可能与CaM分布相关。我们利用q-RT-PCR方法检测了钙通道蛋白CchA、MidA基因表达水平,发现热效应下烟曲霉生物膜中CchA、MidA基因表达上调。实验结果揭示了钙信号系统参与热效应对烟曲霉生物膜的抑制作用。第二章主要探讨了 ALA-PDT对烟曲霉生物膜的抑制效应。首先利用XTT法测定ALA温育的时间和ALA用药的浓度,接着进一步探讨了不同光照剂量的ALA-PDT对体外烟曲霉生物膜的抑制作用。光剂量为25 J/cm2时,烟曲霉生物膜的结构基本上没有变化。使用50J/cm2光剂量照射时,生物膜的结构开始疏松,菌丝缩短。当光剂量调整为1OOJ/Cm2照射时,生物膜的结构更加疏松,菌丝逐渐断裂。光照组、光敏剂组生物膜结构基本不变。结果表明ALA-PDT对体外烟曲霉生物膜具有一定的抑制作用。本研究的第三章主要探讨巨噬细胞针对烟曲霉的免疫反应所发挥的作用,以THP-1巨噬样细胞为研究对象,给予灭活的烟曲霉孢子体外诱导,通过q-PCR、ELISA方法检测发现促炎症因子TNF-α和IL-6表达水平的增加,并呈现时间依赖效应;通过western blotting、共聚焦显微镜证明p38 MAPK、NF-κB等信号分子被激活,且通过流式细胞技术发现胞膜TLR2、TLR4及Dectin-1受体表达下调,证明其参与了对烟曲霉的识别和内吞。接下来我们初步探讨了MiR-146a对烟曲霉感染固有免疫反应的调控作用。首先通过q-RT-PCR检测发现烟曲霉可以诱导THP-1巨噬样细胞miR-146a mRNA表达上调,当分别用受体及信号分子抑制剂阻断后发现THP-1巨噬样细胞miR-146a mRNA的表达均有不同程度的降低,表明miR-146a的表达与TLR2、TLR4和Dectin-1介导的信号通路有关。为了明确miR-146a在烟曲霉感染中具体的调控作用,通过转染miR-146a模拟物及miR-146a抑制剂改变THP-1巨噬样细胞miR-146a的表达,结果发现过表达miR-146a后可抑制THP-1巨噬样细胞对于烟曲霉诱导的炎症因子TNF-α及IL-6 rnRNA表达和蛋白分泌水平;而转染miR-146a抑制剂后,则可促进TNF-α及IL-6 rnRNA的表达和蛋白分泌水平,说明miR-146a可以负向调节IL-6和TNF-α的表达。通过免疫荧光法也观察到,转染miR-146a模拟物后NF-κκB-p65在烟曲霉刺激后转位至细胞核内显著减少,而转染miR-146a抑制剂后NF-κB-p65入核则明显增加;表明烟曲霉感染中miR-146a可能对NF-κB途径发挥了负向的调控作用。采用q-RT-PCR和westemblot分别检测miR-146a的两个靶基因IRAK1和TRAF6 mRNA转录水平及蛋白翻译水平表达情况。上调miR-146a表达后,IRAK1和TRAF6 mRNA表达及蛋白翻译水平均明显抑制,而下调miR-146a表达水平后,IRAK1和TRAF6 mRNA及蛋白表达水平则明显增高。本章结论:烟曲霉刺激THP-1巨噬样细胞活化的TLR2、TLR4和Dectin-1受体及其下游的信号通路引起炎症因子TNF-α和IL-6的表达,miR-146a在烟曲霉诱导THP-1巨噬样细胞产生的炎症反应中发挥了负向调控作用。
【图文】：

图２邋ＣａＭ－ＲＦＰ烟曲霉Ａ１１６０菌株的构建原理不怠图逡逑５．烟曲霉在生长过程中ＣａＭ的动态定位分布：逡逑（１）用ｌｍｌ注射器针头将ＣａＭ－ＲＦＰ烟曲霉Ａ１１６０孢子点接种在单层Ｙ养基的载玻片上，放入不同的温度下培养。逡逑Ｃ２）培养１６ｈ后在不同的时间点取出载玻片，孢子经过一段时间培培养基上形成微小的单菌落。逡逑（３）直接在荧光显微镜下观察长在边缘的单根菌丝中ＣａＭ红色荧光变６．荧光定量ＰＣＲ方法检测相关钙调蛋白ＣｃｈＡ、ＭｉｄＡ的基因表达逡逑（１）烟曲霉生物膜制备：生物膜制备分为３组，对照组、不同的热效４１邋°Ｃ）进行培养。逡逑（２）收集生物膜细胞，加入适量液氮，研磨至粉末状。逡逑（３）细胞总ＲＮＡ的提取按照ＴＲｉｚｏｌ操作说明书具体步骤进行，测出，一ＲＮＡｃＤＮＡ。逡逑

图４不同热效应下烟曲霉细胞生长变化逡逑２．热效应对烟曲霉生物膜活力的影响逡逑利用酶标仪４９０ｎｍ波长处的吸光值（ＯＤ邋４９０）检测生物膜细胞的生长活结果如图５，可以发现，从４ｈ开始，与３７°Ｃ相比，３９°Ｃ，４１°Ｃ组ＯＤ值高，从１０ｈ－１６ｈ，邋３９°Ｃ，，４１°Ｃ组ＯＤ值增加的更为明显，从图中可以看出，与３９°Ｃ组的ＯＤ值也有明显的差别。提示热效应作用下细胞增生更为１６ｈ－２４ｈ，３９°Ｃ，４１°Ｃ组ＯＤ值上升不那么明显，反而３７°Ｃ正常温度组的速上升，在２４ｈ时达到峰值，之后到７２ｈＯＤ值趋于稳定。结果显示在生的后期，与３７°Ｃ正常温度组相比，热效应作用下烟曲霉生物膜的活力则生物膜形成的量也明显减少。逡逑？邋１．２－１逡逑｜逦ｆ一￣？一－？逦－＾３７逡逑？邋１０－逦／逦－Ｂ－邋３９逡逑ｄ0．８－逦／／ａ逦°逦°逦４１逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R519

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本文编号：2620823