T淋巴细胞亚群及其PD-1在布鲁菌感染中的作用及机制研究

发布时间：2020-04-10 06:27

【摘要】：目的:研究布鲁菌病患者和小鼠模型中T淋巴细胞亚群及其PD-1的表达变化及相关性,探讨布鲁菌感染机体后的免疫应答特征对疾病进展、预后的影响,为今后临床对布鲁菌病更有效的诊断和治疗提供思路。方法:(1)通过Meta分析对我国布鲁菌病患者的临床表现、并发症、误诊率和实验室检查进行了系统分析;同时还对国内外有关布鲁菌病患者外周血中T淋巴细胞比例变化的文献进行了Meta分析。(2)对在新疆医科大学第一附属医院就诊的不同分期(急性、慢性及恢复期)的患者和健康对照进行分组,通过流式细胞术检测外周血中T淋巴细胞亚群和PD-1的表达水平,采用流式液相多重蛋白定量技术检测患者血清中T淋巴细胞因子的表达量,进行统计分析各项指标在不同分组间表达的差异及相关性。(3)使用布鲁菌标准毒株16M通过腹腔注射法建立BALB/c小鼠感染布鲁菌的动物模型,将小鼠分为三组:正常对照组,布鲁菌感染模型组(Brucella),PD-1抗体干预组(Brucella+PD-1Ab),应用流式细胞术检测小鼠不同感染阶段PD-1在CD4+和CD8+T淋巴细胞表面的表达;采用流式液相多重蛋白定量技术的方法检测不同感染时期小鼠T淋巴细胞相关细胞因子的表达水平;采用HE染色观察小鼠感染后肝脏的病理,分析布鲁菌感染状态下PD-1对T淋巴细胞相关细胞因子的表达调控以及靶器官炎症损伤发生的影响。结果:(1)关于我国布鲁菌病患者临床特征的Meta分析一共纳入68篇文献,共计报道了12842例患者,男女患者比例为(2.64∶1),79.4%的患者有明确接触史,我国布鲁菌病最常见的临床症状是发热、疲劳、关节痛、出汗和肌肉疼痛。布鲁菌病患者会出现合并伴骨关节炎、肝炎、中枢神经系统功能障碍、心血管疾病、呼吸道症状、睾丸炎或附睾炎、噬血细胞综合征等并发症。与成人患者相比,儿童患者皮疹和呼吸系统、心脏、睾丸炎、附睾炎等并发症的发生率较高。寒战、头痛和体重下降的发病率较成人低。62.5%的患者在首次就诊时发生误诊。常见的异常实验室结果为白细胞减少,其他还有贫血、血小板减少、全血细胞减少以及白细胞增多。(2)患者外周血中T淋巴细胞比例变化的Meta分析共纳入了8个研究,包括患者396例,健康对照212例。结果显示患者CD4+T细胞比例和CD4+/CD8+T细胞比值低于健康对照组(P0.05),CD8+T细胞比例在患者组高于健康对照组(P0.05)。(3)本研究共收集了住院及门诊的125例布鲁菌感染患者病史及外周血标本,其中急性期患者47例、慢性期患者43例、恢复期患者35例,以及30名健康志愿者。急性期布鲁菌患者CD4+T和CD8+T细胞表面PD-1的表达率高于慢性期、恢复期患者和健康对照(P0.05),其在慢性期患者中的表达要高于恢复期患者和健康对照(P0.05)。Th1细胞在急性期患者外周血中比例高于慢性期患者、恢复期患者和健康对照(P0.05)。慢性期患者中Th1的细胞比例要高于恢复期患者和健康对照(P0.05),恢复期患者停药1年以内Th1细胞比例仍高于健康对照(P0.05)。Th1细胞相关的细胞因子IL-2在急性期及恢复期患者中表达高于健康对照(P0.05),IFN-γ在急性期患者中表达显著高于慢性期、恢复期及健康对照组(P0.05)。Th2细胞比例在慢性患者中最高,显著高于急性期、恢复期与健康对照组,在急性期患者中表达比例高于恢复期与健康对照组(P0.05),在恢复期患者与健康对照组之间未见统计学差异(P0.05)。Th2细胞分泌为主的细胞因子IL-4表达水平在慢性期及恢复期患者中表达显著高于急性期与健康对照组(P0.05),慢性期与恢复期患者间表达无显著差异(P0.05),急性期患者表达高于健康对照组,有统计学差异(P0.05);细胞因子IL-5的表达在慢性期患者中高于急性期、恢复期患者及健康对照组(P0.05);细胞因子IL-13在慢性期患者中表达水平显著高于急性期、恢复期患者及健康对照(P0.05)。Th17细胞比例在急性期与慢性期患者中表达均高于恢复期患者和健康对照(P0.05),急、慢性患者间表达未见显著差异(P0.05)。Th17细胞分泌为主的细胞因子IL-17A的表达在急性期、慢性期及恢复期患者中表达无显著差异(P0.05),在三组患者中表达均高于健康对照(P0.05);细胞因子IL-17F在慢性期患者中表达水平最高,显著高于急性期、恢复期患者健康对照组(P0.05)。Treg细胞在急性期与慢性期患者中表达均高于恢复期患者和健康对照(P0.05),急、慢性患者间表达未见显著差异(P0.05)。(4)通过攻毒4周后小鼠血清试管凝集试验和小鼠脾脏细菌培养证实小鼠感染布鲁菌模型建立成功,流式细胞术分析结果显示,感染布鲁菌2周后小鼠外周血中PD-1开始出现增高,感染4周后PD-1表达最高,于第8周出现下调,随后逐渐下降;Th1细胞因子IL-2、IFN-γ于感染2周即升高,IFN-γ在感染4周时表达达高峰,IL-2表达水平随时间逐渐增高;Th2相关细胞因子IL-4、IL-5、IL-13在感染初期升高不明显,在第8周后开始明显升高;Th17相关细胞因子IL-17A在感染4周后表达逐渐增高,IL-17F在感染2周左右开始轻度增高。Th9相关细胞因子IL-9在感染4周开始增高,第8周表达水平达高峰;Th22型细胞因子IL-22于感染1周后升高,并持续维持在较高水平。IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-13、IL-17A的表达水平与感染时间正相关(P0.05),IL-5的表达水平与IL-13、IL-17A和IL-4的表达均呈正相关(P0.05),IL-17F与CD4+和CD8+T细胞表面的PD-1表达呈正相关(P0.05),CD4+与CD8+T细胞表面的PD-1表达正相关(P0.05)。布鲁菌感染小鼠4周后可以观察到肝脏组织出现水肿变性炎症损伤,肝脏炎症病变在8周时程度最重,随着感染时间延长,肝脏炎症损伤开始减轻。给予布鲁氏杆菌感染小鼠PD-1抗体后,CD4+和CD8+T淋巴细胞表面PD-1表达水平下降(P0.05),PD-1抗体干预的小鼠在第4周时细胞因子IL-17和IL-9表达高于Brucella组(P0.05),IFN-γ表达水平低于Brucella组(P0.05)。第12周时Brucella+PD-1Ab组IL-13、IL-4、IFN-γ、IL-2和IL-9的表达水平低于Brucella组(P0.05),IL-17F和IL-22表达则显著高于Brucella组(P0.05)。免疫组化结果显示PD-1抗体处理组的感染小鼠肝脏炎症损伤程度小。结论:(1)我国布鲁菌病患者临床表现复杂多样,可累及多系统,成人与儿童患者中临床表现存在部分差异,布鲁菌患者首诊时易出现误诊,本研究为临床准确及时诊断提供了一定的理论依据。(2)布鲁菌病患者体内存在明显的免疫功能紊乱现象,CD4+和CD8+T细胞可能为影响布鲁菌病进展的免疫因素。(3)患者感染布鲁菌后在急性期以Th1、Th17和Treg细胞免疫为主,慢性期则由Th2、Th17和Treg细胞免疫为主导。同时观察到患者在临床治愈后短时间内免疫功能尚未完全恢复,需要对恢复期患者长期随访。(4)布鲁菌感染引起小鼠外周血中PD-1表达的增高,在感染初期主要以Th1和Th22细胞分泌为主的细胞因子增高,随着病程进展,Th2、Th9、Th17和Th22细胞为主的免疫应答增强;布鲁菌感染后可引起肝脏发生炎症损伤,急性感染阶段肝脏炎症损伤较慢性感染阶段程度重。PD-1抗体可减轻感染小鼠肝脏损伤,PD-1抗体在布鲁菌感染时可调节Th1、Th2、Th17和Th9细胞相关细胞因子的表达,提示PD-1可能参与了布鲁菌感染的细胞免疫调节。
【图文】：

CD3+T细胞数据的漏斗图

细胞数

图1-4 CD3+T细胞数据的 Egger图Figure1-4 Egger diagram of CD3+T cell data文献中，两篇研究结果显示布鲁菌病患者组中CD3+T细献研究结果示CD3+T细胞比例在患者组与健康对照组学异质性较大（I2=85.6%，95% CI（72.4%；92.5%），模型进行分析（见图1-5）。结果显示：布鲁菌病患病组对照组的趋势，但两者差异无统计学意义[MD=1.1319），P=0.3631]。所以，尚不能认为布鲁菌病患病组照组。
【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R516.7

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