分枝杆菌细胞壁脂质PDIM诱导Gal-3调控炎症与肉芽肿形成的意义及其机制

发布时间：2020-04-10 08:19

【摘要】：目的:研究鉴定分枝杆菌细胞壁脂质PDIM诱导Gal-3表达的TLR信号通路,明确Gal-3对PDIM调控炎症介质释放的影响及其机制;并进一步研究Gal-3对PDIM介导肉芽肿形成的意义与机制。方法:将Raw264.7细胞分为正常对照组(Mock)、WT野生株和PDIM缺失突变株(命名为△PDIM)感染组。(1)Western blot检测各感染组0.5-4 h内Gal-3蛋白表达,qRT-PCR检测Gal-3 mRNA表达,细胞免疫荧光检测各组感染4 h时Gal-3蛋白表达强度,并统计比较各感染组不同时间点胞内菌数量,明确PDIM诱导Gal-3蛋白表达与侵入胞内的细菌数量无关。(2)Western blot和qRT-PCR分别检测各感染组0.5-4 h内TLR2和TLR4蛋白与mRNA表达变化;并分别使用TLR2受体特异性抑制剂(C29)和NF-κB特异性转录活性抑制剂(JSH-23)预处理细胞,western blot和qRT-PCR分别比较各感染组0.5-4 h Gal-3蛋白和mRNA表达,初步明确PDIM诱导Gal-3表达的TLR信号通路。(3)各组感染4 h时,qRT-PCR检测TNF-α、IL-6、iNOS、IL-10和TGF-β表达,western blot检测各感染组0.5-4 h内ERK、NF-κBp65和IKK总蛋白及其磷酸化水平,confocal观察Gal-3与NF-κBp65的共定位情况,免疫共沉淀(Co-IP)检测Gal-3与NF-κBp65之间的相互作用。(4)转染Gal-3的siRNA干扰质粒到Raw264.7细胞,再感染WT和△PDIM菌株4 h,qRT-PCR检测各感染组TNF-α、IL-6、iNOS、IL-10和TGF-β表达,confocal检测各感染组中Gal-3与NF-κBp65的胞内表达及定位情况。(5)构建Gal-3过表达质粒并转染Raw264.7细胞,再感染△PDIM菌株4 h,qRT-PCR检测TNF-α、iNOS和TGF-β表达,confocal检测Gal-3表达以及NF-κBp65入核情况,明确PDIM诱导Gal-3对NF-κB活化及下游炎症相关因子表达变化影响。(6)建立海分枝杆菌小鼠尾静脉感染模型,然后再注射Gal-3特异性抑制剂TD139,比较大体病变和计算病变面积,组织匀浆铺板计数载菌量,HE染色和抗酸染色观察小鼠尾部组织病理变化及细菌分布,免疫组化染色和图像分析技术检测小鼠组织中Gal-3、TNF-α和MMP-9蛋白表达与分布,明确TD139对小鼠组织损伤的干预效应。结果:(1)海分枝杆菌感染小鼠Raw264.7巨噬细胞后,WT感染组中Gal-3蛋白和mRNA均呈上升趋势;细菌侵染实验发现,含有PDIM的WT菌株诱导Gal-3表达与侵入Raw264.7细胞内的细菌数无关。(2)相比于△PDIM感染组,WT感染组中TLR2蛋白和mRNA表达逐渐升高,而两组中TLR4蛋白和mRNA表达均降低;使用TLR2受体特异性抑制剂(C29)和NF-κB特异性转录活性抑制剂(JSH-23)预处理细胞后,WT感染组中Gal-3蛋白和mRNA表达明显降低,提示PDIM可能通过TLR2/NF-κB通路诱导Gal-3表达。(3)感染4 h后,相比于WT感染组,△PDIM感染组中促炎因子TNF-α、IL-6和iNOS表达显著升高,而抑炎因子IL-10和TGF-β表达降低,且差异显著。Western blot检测发现WT感染组中ERK、NF-κBp65和IKK蛋白的磷酸化水平较低,而△PDIM感染组中ERK、NF-κBp65和IKK蛋白则是持续磷酸化状态,表明PDIM可抑制宿主细胞早期免疫反应。Confocal观察发现Gal-3和NF-κBp65存在明显共定位,并且Co-IP证实两者之间存在较强的相互作用,说明PDIM诱导Gal-3可抑制NF-κB活化及下游炎症相关因子表达。(4)转染Gal-3的siRNA干扰质粒到Raw264.7细胞后,能完全逆转WT感染组中促炎因子和抑炎因子的表达趋势,并且显著增加NF-κBp65入核活化率。(5)转染Gal-3过表达质粒到Raw264.7细胞后,也能逆转△PDIM感染组中炎症介质表达,并且显著降低NF-κBp65入核活化率(6)小鼠尾静脉感染模型中,WT感染组小鼠尾部出现明显肿胀、溃烂,组织病理学观察发现有典型肉芽肿病变,并检测到大量细菌,TNF-α和MMP-9表达呈强阳性;给予WT感染组小鼠注射TD139干预后,小鼠尾部病变得到明显改善,TNF-α和MMP-9炎性介质表达减少;而△PDIM感染组小鼠尾部有轻微肿胀,仅检测到少许细菌。结论:分枝杆菌细胞壁脂质PDIM可能通过TLR2/NF-κB通路诱导Gal-3表达,Gal-3负反馈于NF-κB信号通路并抑制TNF-α和IL-6等促炎因子表达,帮助细菌逃避宿主早期免疫杀伤;动物感染实验中Gal-3可促进TNF-α和MMP-9分泌并介导组织损伤及肉芽肿形成。
【图文】：

分枝杆菌,脂质,细胞,细胞壁

2 分枝杆菌细胞壁脂质 PDIM 对 Raw264.7 细胞 TLR2 和 TLR4 表达的的影响（n注：与 WT 感染组比较，*P<0.05，**P<0.01，NS 无统计学意义 TLR2 特异性抑制剂（C29）和 NF-κ' 转录活性特异性抑制剂（Jal-3 表达的影响果如图 3 所示，使用 C29（200μ2）和 JSH-23（20μ2）预处理细胞，孵育细胞。A 图 western blot 结果显示，相较于正常感染组，使用 C29 和胞后，WT 感染组中 Gal-3 蛋白表达均呈逐渐下降趋势。B 图 qRT-PCR用 C29 和 JSH-23 处理细胞后，WT 感染组中 Gal-3 mRNA 的表达也明显

抑制剂,蛋白表达,检测细菌,蛋白

图3 TLR2受体抑制剂（C29）和NF-κB活性抑制剂（JSH-23）对Gal-3蛋白表达的影响（n=3注：与 WT 感染组比较，*P<0.05，**P<0.01，NS 无统计学意义.1.4 分枝杆菌细胞壁脂质 PDIM 对 NF-κ' 信号活化及炎症相关因子表影响结果如图 4 所示，A 图为 qRT-PCR 检测细菌感染细胞 4 h 后 TNF-α、IL-6、iNOSL-10 和 TGF-β 表达变化，△PDIM 感染组促炎因子相比于 WT 感染组显著升P<0.05）；WT 感染组较△PDIM 感染组抑炎因子显著升高（P<0.05），且与 Mo无差异，而抑炎因子均升高（P<0.05）。B 图为 western blot 检测细菌感染细胞 0.5，，ERK、NF-κ'p 和 IKK 蛋白及其磷酸化变化，相比于△PDIM 感染组，WT 感中 Phospho-ERk 蛋白降低较快，NF-κ'p 和 IKK 磷酸化蛋白呈先升高后降低， 4 h 降低最明显，而△PDIM 感染组中 NF-κ'p 和 KK 蛋白呈持续磷酸化状态。
【学位授予单位】：三峡大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R52

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