致命鹅膏肝毒性及鹅膏肽类毒素在比格犬体内毒代动力学初步研究

发布时间：2020-04-29 04:58

【摘要】：世界各地均有进食蘑菇而引发中毒的报告。在我国,毒蘑菇中毒所致死亡人数和其病死率均居食物中毒的首位。在蘑菇中毒中,高达90%的死亡是由含鹅膏肽类毒素的蘑菇引起。近年,在含鹅膏肽类毒素的蘑菇识别取得了较大进展,研究发现,我国含鹅膏肽类毒素的蘑菇的种类与欧美有较大差别,其中致命鹅膏作为我国特有的鹅膏属蘑菇种类,在2000-2014年,仅明确诊断的事件就有25起,导致至少99人中毒,48人死亡。此种导致的中毒事件2000年首次在广东报道,目前尚未有致命鹅膏完整病例报道,缺乏致命鹅膏中毒临床特征数据;在含鹅膏肽类毒素的蘑菇中毒治疗方面,尚无特效解毒剂,临床常用的治疗手段包括洗胃、口服活性炭、利尿剂使用、胆汁引流和血液净化技术等方法,试图通过改变鹅膏肽类毒素在体内毒代动力学过程来达到治疗目的,但由于缺乏临床实践中可用暴露标志物,无合适的动物模型,鹅膏肽类毒素在血液中动态变化过程和排泄特征不完全清楚,临床干预缺乏理论基础。鉴于此,我们从以下两方面进行研究(1)通过开展蘑菇中毒事件调查,收集致命鹅膏中毒病例,探讨我国含鹅膏肽类毒素蘑菇致中毒性肝损害的临床特点;(2)通过建立致命鹅膏致比格犬中毒肝损害模型及比格犬长期胆汁引流模型,描述三种鹅膏肽类毒素在比格犬血液中动态变化和排泄过程,计算三种鹅膏肽类毒素的毒代动力学参数,寻找三种鹅膏肽类毒素排泄规律,为临床毒素清除治疗提供理论依据。第一部分致命鹅膏中毒临床特征研究目的:调查致命鹅膏中毒事件,收集致命鹅膏中毒病例,探讨我国含鹅膏肽类毒素蘑菇致中毒性肝损害临床特点。方法:2014-2015年,在云南对三起致命鹅膏中毒事件进行调查,共收集10例致命鹅膏中毒病例,采集三起中毒事件蘑菇标本5份,采集病例血液样本25份,尿液样本5份。应用形态学和分子生物学方法对事件中5份蘑菇标本进行鉴定;应用UPLC-ESI-MS-MS方法对致命鹅膏子实体、中毒病例血液和尿液样本进行5种鹅膏肽类毒素检测;通过查阅病历,整理分析中毒病例一般人口学信息、蘑菇摄入量、临床表现,实验室检查和治疗情况等信息。结果:三起事件收集到的蘑菇经形态学、ITS序列比对及系统发育分析鉴定为鹅膏属檐托鹅膏组中的致命鹅膏。致命鹅膏不同部位鹅膏肽类毒素含量由高到低依次为菌盖、菌柄、菌托;致命鹅膏中不同种类毒素含量由高到低依次为α-amanitin、Phallacidin、β-amanitin和γ-amanitin。10例致命鹅膏中毒病例从食入蘑菇到出现中毒表现的平均时间为13.9 + 2.1 h,从食入蘑菇到入院的平均时间为49.6 + 8.5 h。致命鹅膏中毒的最常见首发症状为呕吐和腹泻(发生率100%)。4例患者死于肝功能衰竭,6例患者康复后出院。食入致命鹅膏后2d,患者ALT、AST、TBIL、DBIL、PT 和 APTT 水平出现明显升高(ALT 653.3 U/L;AST 509.8 U/L;TBIL 43.9 μmol/L;DBIL 23.1 μmol/L;PT 23.7 s;APTT 43.8 s);食入蘑菇后 3d,患者 ALT、AST、PT 和 APTT 水平达到峰值(ALT 1018.6 U/L;AST 903.4 U/L;PT49.8 s;APTT 79.8 s);食入蘑菇后7 d,患者TBIL和DBIL水平达到峰值(TBIL 88.8μmol/L;DBIL83μmol/L);指标达峰后,患者 ALT、AST、TBIL、DBIL、PT和APTT水平逐渐下降,在食入蘑菇后14 d恢复至正常水平。将中毒病例分为死亡组病例和存活组病例分析发现,两组病例ALT、AST、TBIL、DBIL、PT和APTT指标变化趋势相同,但死亡组病例各个指标升高幅度更大。食入致命鹅膏48h后,中毒病例血液中无法检测到鹅膏肽类毒素;食入致命鹅膏96h内,部分中毒患者尿液中可检测到鹅膏肽类毒素。结论:致命鹅膏主要在亚热带地区雨季生长,是世界上毒性最大的蘑菇种类之一。致命鹅膏中毒病例以长潜伏期(6-24h)、前期胃肠炎症状和后期肝损害表现为特点。病例食入致命鹅膏48 h内的血液和96 h内的尿液样本中鹅膏肽类毒素检测具有诊断价值。第二部分鹅膏肽类毒素在比格犬体内毒代动力学初步研究2.1比格犬致命鹅膏中毒肝损害模型及长期胆汁引流模型建立目的:通过建立致命鹅膏致比格犬中毒肝损害模型,为含鹅膏肽类毒素蘑菇中毒的诊断和治疗等相关研究打下基础;通过建立比格犬长期胆汁引流模型,为含鹅膏肽类毒素蘑菇中毒在内的胆汁相关疾病提供研究手段。方法:将12只健康雄性比格犬随机分入60mg/kg致命鹅膏组和胆汁引流组,每组6只。60 mg/kg致命鹅膏组用于建立比格犬致命鹅膏中毒肝损害模型,胆汁引流组用于建立比格犬长期胆汁引流模型。60mg/kg致命鹅膏组中,UPLC-ESI-MS-MS法测定致命鹅膏干粉中鹅膏肽类毒素含量,胶囊喂饲比格犬60 mg/kg致命鹅膏干粉,观察其中毒表现及死亡情况,通过检测凝血及肝肾功能、肝脏病理以及血浆和尿液中鹅膏肽类毒素含量,用于比格犬致命鹅膏中毒肝损害模型观测指标;对胆汁引流组中比格犬进行胆总管结扎胆囊穿刺引流术,术后犬穿戴上内部保护衣、外部保护衣、胸带、伊丽莎白项圈后,将引流袋放入外部保护衣背包。术后每日观察比格犬手术切口及一般状况,观察胆汁性质并记录每日引流量,使用犬代谢笼收集并记录每日尿量,同时测定比格犬术后凝血及肝功能指标变化情况,术后28d处死胆汁引流组中比格犬,并取肝脏组织进行病理检查。结果:本研究所用致命鹅膏干粉中鹅膏肽类毒素总含量为3482.6± 124.94 mg/kg。比格犬致命鹅膏中毒肝损害模型犬在12-48h出现呕吐和腹泻等症状,染毒24h,模型犬ALT、AST、TBIL、ALP、PT和APTT水平出现明显升高,染毒后36h,ALT、AST、PT和APTT水平达到峰值(ALT:283.2卡门氏单位;AST:125.6卡门氏单位;PT:132.9 s;APTT:131.4 s),染毒后48 h,TBIL和ALP值达到峰值(TBIL:23.3 μmol/L;ALP:274.5U/L),模型犬 TBIL、TP 和 APTT 在染毒后1周恢复至正常水平,ALT、AST和ALP在染毒后3周恢复至正常水平。染毒后24-72h死亡3只,肝脏病理检查显示弥漫性肝细胞出血性坏死。染毒后24h内,血浆中可检测到鹅膏肽类毒素;染毒后92 h内,尿液中可检测到鹅膏肽类毒素。胆汁引流组中比格犬在术后一周手术切口愈合,拆线,术后2天内精神不振,食欲下降,活动减少,术后第4d基本正常。比格犬胆汁引流术后第Id、2d和3d的ALT、AST和ALP指标,与术前比较,差异具有统计学意义(P值均小于0.05),出现轻微升高(升高幅度均在术前一倍以内),并在一周后恢复至正常水平。比格犬胆汁引流术不同时间点TBIL、DBIL、PT、APTT、BUN和CRE指标,与术前比较,差异无统计学意义(P值均大于0.05)。术后28 d比格犬肝脏未出现明显病理改变。胆汁引流组比格犬每日尿量为250.4±19.1 mL/d,每日胆汁引流量为69.9±6.1 mL。结论:致命鹅膏可引起肝细胞出血性坏死,导致急性肝功能衰竭,该模型符合含鹅膏肽类毒素蘑菇致中毒性肝功能损害的临床病理生理特点和鹅膏肽类毒素在血液和尿液中的检出时限,可应用于含鹅膏肽类毒素蘑菇中毒的诊断和治疗相关研究;比格犬长期胆汁引流模型可在犬正常生理活动状态下长期(至少28 d)监测胆汁排泄情况,可应用于鹅膏肽类毒素胆汁排泄及其它胆汁相关疾病的研究。2.2鹅膏肽类毒素在比格犬血液中动态变化及排泄研究目的:描述三种鹅膏肽类毒素在比格犬血液中动态变化和排泄过程,计算三种鹅膏肽类毒素的毒代动力学参数,寻找三种鹅膏肽类毒素排泄规律,探讨胆汁引流在鹅膏肽类毒素蘑菇中毒过程中的作用,为临床毒素清除治疗提供理论依据。方法:36只雄性比格犬分随机分为空白对照组、胆汁引流组、20mg/kg致命鹅膏组、20mg/kg胆汁引流组、60mg/kg致命鹅膏组和60mg/kg胆汁引流组,每组6只。20 mg/kg胆汁引流组和60 mg/kg胆汁引流组中比格犬在接受胆总管结扎胆囊穿刺胆汁引流手术后第7 d经口胶囊喂饲20 mg/kg和60 mg/kg致命鹅膏干粉。空白对照组和手术对照组比格犬喂饲空胶囊。观察其各个实验组中比格犬中毒表现及死亡情况,通过检测凝血及肝肾功能、肝脏病理进行毒效学研究。应用UPLC-ESI-MS-MS法测定致命鹅膏干粉中及染毒后不同时间点比格犬血液、尿液、胆汁及粪便中三种鹅膏肽类毒素含量,计算鹅膏肽类毒素毒代动力学参数和排泄量。通过比较胆汁引流组和非胆汁引流组之间鹅膏肽类毒素毒代动力学参数和排泄量之间的差异,分析胆汁引流在鹅膏肽类毒素蘑菇中毒过程中的作用。结果:空白对照组、胆汁引流组和20mg/kg胆汁引流组中,所有比格犬均未出现任何中毒表现及死亡发生。染毒后12-48 h,20 mg/kg致命鹅膏组、60 mg/kg致命鹅膏组和60 mg/kg胆汁引流组中,分别有33.3%、100%和50%比格犬出现呕吐和腹泻。60 mg/kg致命鹅膏组中3只比格犬因肝衰竭死亡,其它各实验组中比格犬无死亡发生。20 mg/kg致命鹅膏组和60 mg/kg致命鹅膏组中,染毒后24 h,比格犬ALT、AST、TBIL、ALP、PT、APTT和INR水平出现明显升高;染毒后 36h,ALT,AST,PT、APTT 和 INR 达到峰值;染毒后 48h,TBIL 和 ALP值达到峰值;达到峰值后,存活比格犬TBIL、DBIL、PT、APTT和INR水平在染毒后1周恢复至正常水平,其ALT、AST和ALP水平在染毒后3周恢复至正常水平。试验期间动物BUN和CRE水平正常。在相同染毒剂量下,胆汁引流组与非胆汁引流组相比,凝血及肝肾功能指标具有相似的变化规律,但升高幅度更大。60 mg/kg致命鹅膏组中比格犬肝脏病理检查发现肝细胞出血性坏死,其它各实验组中比格犬肝脏未见明显病理改变。三种鹅膏肽类毒素的主要毒代动力学参数如下:Tmax在1.25-2.08 h之间,MRT在1.95-3.82 h之间,消除半衰期T1/2在0.54-1.94h 之间,CLs在 0.12-0.54 L/h/kg 之间,α-Amanitin 和 β-Amanitin 的表观分布容积Vz/F在0.04-0.12 L/kg,Phallacidin的表观分布容积Vz/F为0.43 L/kg。尿中三种鹅膏肽类毒素0-2 d排泄量占尿中排泄总量90%以上,比格犬0-1 d粪便中三种鹅膏肽类毒素排泄量占粪便中总排泄量的90%以上,三种鹅膏肽类毒素的胆汁排泄量占尿液和胆汁排泄总量的比例小于20%;在相同外暴露剂量下,胆汁引流组与非胆汁引流组相比,中毒表现和病理损伤更轻、血生化水平升高幅度更小、血、尿中毒素含量更低,粪便中毒素排出量更高。结论:三种鹅膏肽类毒素经胃肠道吸收迅速,在血液中清除迅速,三种鹅膏肽类毒素在食入含有鹅膏肽类毒素蘑菇后48 h内血液中可检测到鹅膏肽类毒素,提示在中毒后2d内采取血液净化技术,可能达到清除毒素的效果;α-Amanitin和β-Amanitin主要分布在细胞外液中,Phallacidin在体内分布更广泛;鹅膏肽类毒素的胆汁排泄量占尿液和胆汁排泄总量的比例小于20%,但胆汁中毒素来源于肝细胞,这部分毒素是起到肝毒性作用剂量,尚不能判断胆汁引流是否有效;胆汁在鹅膏肽类毒素的肠道吸收过程中起到促进作用,但机制尚不清楚。
【图文】：

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逑ＥＨＩ逡逑图１－２．致命鹅膏子实体（Ａ）来源于腾冲中毒现场（Ｂ）来源于楚雄中毒现逡逑场逡逑？逦Ｖ邋：邋＼：邋．；；；■＇邋■；邋■邋Ｗ．邋＂逡逑？逦Ｖ邋？？逡逑ｍｍ逡逑ｗ＾＼逦广邋＊逡逑图１－３．致命鹅膏１００倍显微镜下照片（Ａ）致命鹅膏担孢子，棉兰染色（Ｂ）致逡逑命鹅膏担子，５％邋ＫＯＨ。注：致命鹅膏具有特征性的是白色子实体和担子具有两逡逑小梗。逡逑１．３．１．２分子生物学鉴定逡逑将中毒事件样本中的蘑菇的ＩＴＳ序列在ＧｅｎＢａｎｋ中比对，结果为致命鹅膏逡逑（见表１－４）。基于ＩＴＳ序列构建的致命鹅膏系统发育树显示，致命鹅膏和其它文逡逑献中报道的含鹅膏肽类毒素的鹅膏属蘑菇聚集在檐托鹅膏组（详见图１邋３）。逡逑３１逡逑

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【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R595.7

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