乙型肝炎病毒母婴传播阻断策略和病毒变异与阻断失败关系的研究

发布时间：2020-05-17 12:10

【摘要】：背景:母婴传播(Mother-to-Child transmission,MTCT)是我国乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)主要传播方式及造成HBV慢性感染的主要原因。即使给予婴儿乙肝疫苗及乙肝免疫球蛋白(hepatitis B immunoglobulin,HBIG)主动-被动联合免疫阻断,仍有10%左右母亲所生婴儿发生HBV感染。研究HBV MTCT阻断机制、明确MTCT阻断失败原因、探索及不断完善阻断策略是国内外学者共同关心的问题。母亲高病毒血症逐渐被证实是引起HBV MTCT阻断失败的主要原因,为降低母体HBV DNA载量,有研究提出妊娠期给予核苷(酸)类似物(Nucleos(t)ide Analogue,NA)抗病毒治疗的建议。妊娠期应用抗病毒药物治疗可以分成两种情况,一种是慢性HBV感染的患者在妊娠期出现肝功异常,丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)≥2×正常值上限(Upper Limit of Normal,ULN),进入HBV感染免疫清除期,需要随时治疗;另一种情况是肝功能正常的HBV携带者在妊娠末期应用抗病毒药物来阻断HBV MTCT。妊娠期抗病毒治疗究竟能不能降低HBV MTCT的比例,药物对于胎儿的影响及安全性究竟如何需要进一步的证实。而对于HBV感染免疫耐受期的孕妇来说,抗病毒治疗究竟能不能起效,NA的干预能不能引起肝脏炎症的激活尚不清楚,大量研究都建议产后1-3个月停药,但是患者能不能哺乳,究竟什么时候停药更合适、更安全,免疫耐受期的治疗能不能增加病毒突变产生对NA的耐药等,这些问题都没有一致答案,临床上还需要更多的循证医学证据。因为HBV复制过程中所需的逆转录酶缺乏校正功能,HBV基因异质性广泛存在,其中研究较多的是S基因变异对MTCT的影响。但在NA药物临床广泛应用的选择压力下,HBV P基因尤其是逆转录酶(Reverse Transciptase,RT)区变异株从病毒准种中选择出来并可能成为优势株而流行。而HBV P与S基因相互重叠,NA药物治疗后所产生的HBV P基因耐药变异株流行能否直接影响乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)的特性和功能,从而产生新的免疫逃逸株,造成HBV MTCT阻断失败尚不清楚。目的:1、NA药物替比夫定(Telbivudine,LdT)应用于HBV感染孕妇,包括慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者和免疫耐受期高病毒血症患者,评价其减少母婴传播的有效性,以及观察胎儿及婴儿出生后的安全性。2、HBV感染免疫耐受期高病毒血症孕妇妊娠末期应用LdT治疗,观察其病毒学应答情况以及ALT升高肝炎激活的比例,以评价其疗效和安全性,并探讨停药时机。3、比较HBV免疫阻断失败母-子/女与免疫阻断成功母亲HBV P/S基因变异特点,预测其变异导致蛋白质二级结构改变对于功能的影响。材料与方法:第一部分:LdT阻断HBV MTCT有效性及婴儿安全性的研究:这是一项前瞻、开放、多中心研究,选择2011年1月—2014年4月就诊于中国医科大学附属盛京医院感染科门诊及沈阳市第六人民医院肝病科门诊的HBV感染孕妇,年龄19-45岁。若ALT正常的HBV携带孕妇,则需妊娠24周-32周,ALT≤40U/L,HBV DNA≥1×10~5IU/ml;若ALT升高的慢性乙型肝炎孕妇,则需ALT≥2×ULN,同时HBeAg阳性者HBV DNA≥20000IU/ml或HBeAg阴性者HBV DNA≥2000IU/ml,给予LdT600mg每日1次口服。所有婴儿给予标准主-被动联合免疫。若婴儿7月龄时HBsAg阳性或HBV DNA阳性,则证实为免疫阻断失败,发生HBV MTCT。观察HBV母婴阻断成功率、胎儿及婴儿安全性。第二部分:HBV感染免疫耐受期孕妇应用LdT治疗效果及停药安全性的研究:上述研究对象中HBV携带免疫耐受期高病毒血症(HBV DNA≥5 log_(10)IU/ml)患者:ALT正常(ALT≤40U/L),除外肝硬化。LdT抗病毒治疗从妊娠24-32周开始直至分娩前。分娩前检测HBV DNA载量,若HBV DNA阳性(HBV DNA20 IU/ml),分娩后立即停药,停药后1周孕妇即可哺乳;若HBV DNA阴性,分娩后继续抗病毒治疗。观察孕妇治疗过程中病毒学应答效果;ALT升高肝炎激活的比例,以评价孕妇的安全性。第三部分:HBV母婴传播免疫阻断失败母子基因异质性的研究:选择2011年11月—2014年2月在中国医科大学附属盛京医院感染科就诊的HBsAg(+)且HBV DNA(+)的10对母亲及其子女,母婴阻断成功且HBV DNA(+)的18位母亲作为研究对象,父亲HBV血清标志物阴性。母亲年龄为20岁-45岁;子女年龄为1岁-9岁,在出生时均接受乙型肝炎疫苗全程免疫,母亲及其子女肝功能均正常,从未接受NA治疗,留取其血清标本。上述标本检测HBV DNA载量及提取DNA,行全P区基因测序。从NCBI的BLAST操作平台,收集GenBank中的8条HBV DNA标准株。截取标准株与测序结果的精确同源位碱基序列,应用DNASTAR软件分析,应用Megalign程序进行多序列比较及配对比较、同源性分析;Phylogenetic Tree进行基因分型;应用EditSeq进行氨基酸序列翻译,判断HBV血清型,应用Protean进行P/S区的蛋白质二级结构预测分析,选择用Chou-Fasman方法进行蛋白质二级结构中α-螺旋、β-折叠和β-转角的预测,采用Gamie-Robson方法进行无规则卷曲预测,采用Karplus-Schulz方法进行柔韧性分析,采用Jameson-Wolf方法进行抗原性分析。结果:第一部分:LdT阻断HBV MTCT有效性及婴儿安全性的研究:1)共纳入治疗组135例,其中ALT正常患者93例(93/135,68.89%),ALT≥2×ULN的CHB患者42例(42/135,31.11%),观察组患者30例。135例治疗组孕妇平均年龄为27.81±4.33岁(范围:20-42),基线HBV DNA为7.82±1.04 log_(10)IU/ml(范围:4.67-9.53),ALT平均值为89.2±134.27U/L(范围:6-839)。平均开始治疗的孕周为24.51±5.89周(范围:4-38)。30例观察组患者平均年龄27.43±4.88岁(范围:19-39),基线HBV DNA为7.61±1.29 log_(10)IU/ml(范围:5.11-9.72),ALT平均值为60.6±120.01U/L(范围:9-582)。两组各项基线值比较无差异。2)135例治疗组患者中,有2例(2/135,1.48%)患者在治疗5天及治疗13天后分别发现胎儿唇裂及胎死宫内,这2例均为ALT升高的CHB患者。其余133例患者治疗过程中监测胎儿发育成长正常。共分娩134例婴儿,所有婴儿无先天畸形,出生时Apgar评分正常,发育良好。3)婴儿出生后7个月,治疗组HBV母婴传播率为0,而对照组中完成随访的21例患者中2例(2/21,9.52%)发生HBV感染,两组相比差异有统计学意义(P=0.0220.05)。第二部分:HBV感染免疫耐受期孕妇应用LdT治疗效果及停药安全性的研究:1)91例孕妇接受LdT 600mg每日1次口服治疗(治疗组),26例孕妇未接受抗病毒治疗(对照组)。治疗组基线HBV DNA平均值为8.15±0.82 log_(10)IU/ml(range:5.54-9.53);治疗1个月时,2例(2/91,2.20%)孕妇因HBV DNA较基线下降小于2 log_(10)IU/ml更换为替诺福韦酯(Tenofovir disoproxil fumarate,TDF)序贯治疗;分娩前,HBV DNA较基线下降4.20 log_(10)IU/ml,平均值为3.95±0.94 log_(10)IU/ml(range:0-5.34)(P0.0001)。87例停药患者在分娩后1个月HBV DNA反弹至8.06±0.83log_(10)IU/ml(range:5.22-8.95)。2)4例(4/91,4.40%)患者分娩后继续治疗,其中2例(2/91,2.20%)为分娩时HBV DNA阴转,另2例(2/91,2.20%)为治疗过程中ALT升高。其余87例(87/91,95.6%)患者分娩后立即停药,仅3例(3/87,3.45%)发生停药后ALT升高,其中2例为分娩后1个月ALT分别升至4×ULN和6×ULN,另外1例为分娩后3个月ALT升至16×ULN,3例停药后ALT升高患者均无肝功能失代偿表现,重新抗病毒治疗1个月后ALT复常。第三部分:HBV母婴传播免疫阻断失败母子基因异质性的研究:1)10对免疫阻断失败母子/女中,母亲(Failure Mother组,FM组)HBV DNA平均值为7.44±1.44 log_(10)IU/ml(范围:5.82-8.86),子女(Child组,C组)HBV DNA平均值为7.56±0.96 log_(10)IU/ml(范围:4.44-9.35),两组间相比无显著差异(P=0.3590.05)。而18位HBV母婴阻断成功母亲(Successful Mother组,SM组)血清HBV DNA平均值为7.95±0.66 log_(10)IU/ml(范围:6.41-8.92),与阻断失败母亲血清HBV DNA相比无显著差异(P=0.4530.05)。2)10对母子/女中母婴基因型相同的9对,其中B基因型3对(M2-C2、M5-C5、M6-C6),C基因型6对(M1-C1、M3-C3、M4-C4、M7-C7、M8-C8、M9-C9),另有1对母婴(M10-C10)基因型不同,分别为母亲C型(M10)和女儿B型(C10)。10对母子血清型均为adr。而18位HBV免疫阻断成功母亲中基因B型4例(4/18,22.22%),基因C型14例(14/18,77.78%)。血清型则分别为adr 13例(13/18,72.22%),adw 5例(5/18,27.78%)。两组在基因型和血清型上差异无统计学意义(P0.05)。10对免疫阻断失败母子/女中有4对同源性100%(M1-C1、M7-C7、M8-C8、M9-C9),均为基因C型;另外2例基因C型母子/女(M3-C3、M4-C4)同源性分别为99.7%和99.1%。而基因B型的3例母子/女(M2-C2、M5-C5、M6-C6)P基因同源性分别为99.3%、99%、98.8%。母女基因型不同的M10和C10同源性仅为94%。3)10对免疫阻断失败母子/女及18位免疫阻断成功母亲在HBV P基因RT区(nt130-1161)核苷酸序列高度一致,在NA容易导致的主要耐药位点80、169、173、180、181、184、202、204、236、250无一例出现突变。但母婴阻断失败3对母子/女在其他14个位点(14/1032,1.36%)出现了核苷酸点突变,其中4处有义突变为ntA289T(C3)、ntC446G(M1/C1)、ntA895T(M3/C3、M9/C9)、ntG1114A(M9/C9),导致rtT54S、rtS106C、rtS256C、rtA329T氨基酸的变化。而蛋白质二级结构预测发现其在α-螺旋、β-折叠、β-转角均与同基因型参考株有差异,导致分子量、长度、等电点及抗原性指数均有差异。S基因也出现N3S(M10)、A45T(C3)及L98V(M1/C1)变异,蛋白质二级结构预测分析显示其抗原性指数较同基因型参考株有变化,但在HBsAg“a”决定簇(AA124-147)内并未发现变异。结论:1.妊娠期应用LdT抗病毒治疗能显著降低婴儿HBV感染率,减少HBV MTCT;LdT抗病毒治疗安全性好,婴儿无严重不良反应发生。2.HBV感染高病毒血症免疫耐受期孕妇在妊娠24-32周应用LdT治疗可以有效降低母体HBV DNA载量;若孕妇在分娩前HBV DNA仍阳性,分娩后立即停药安全,发生停药后肝炎发作的比例低,再治疗有效。3.HBV免疫阻断失败母亲与子女与免疫阻断成功母亲相比,S基因存在“a”抗原决定簇以外的变异,N3S、A45T和L98V,这些变异能导致蛋白质二级结构发生改变。
【图文】：

基线,患者,血清,平均值

图 2. 治疗组完成治疗的 133 例患者基线及分娩前 HBV DNA 变化组完成治疗患者分娩前血清 HBV DNA 平均值为 2.99±1.78 log10IU/m（l范下降 4.83 log10IU/ml（P＜0.0001）。

患者,情况,基线,血清

图 2. 治疗组完成治疗的 133 例患者基线及分娩前 HBV DNA 变化133 例治疗组完成治疗患者分娩前血清 HBV DNA 平均值为 2.99±1.78 log10IU/m（l范围：0-5.34），，较基线值下降 4.83 log10IU/ml（P＜0.0001）。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R512.62

【参考文献】