新型靶向DC慢病毒载体通过自噬途径诱导HBV特异性CTL反应的实验研究

发布时间：2020-05-17 18:46

【摘要】：目的:构建新型双分子表达靶向DC慢病毒载体LVDC-UbHBcAg-LIGHT;明确该重组慢病毒在BALB/c小鼠体外和体内是否能靶向转染DC;探讨LIGHT是否能协同诱导HBV特异性CTL免疫反应;比较LVDC-UbHBcAg-LIGHT和LV-UbHBcAg-LIGHT诱导特异性CTL反应的能力,并进一步验证LVDC-UbHBcAg-LIGHT在HBV转基因小鼠体内的抗病毒作用;探讨细胞自噬、凋亡和周期及以上通路相关蛋白在T细胞激活中蛋白水平的变化及相互作用,阐明LVDC-UbHBcAg-LIGHT介导的CTLs活化机制。方法:1.在本实验室之前合成并保存质粒pLOV-UBC-Ub-HBcAg-EGFP-3FLAG的基础上进行双酶切,插入新合成的EGFP-P2A-Tnfsf14-3FLAG基因,得到双分子表达质粒pLOV-UBC-Ub-HBcAg-EGFP-P2A-LIGHT-3FLAG;封闭SVG基因的硫酸乙酰肝素受体结合位点而保留DC-SIGN结合位点,得到能靶向DC的包膜质粒SVGmu;进而包装成重组慢病毒载体LVDC-UbHBcAg-LIGHT。2.建立表达梯度DC-SIGN蛋白水平的293T细胞模型,分别用LVDC-UbHBcAg-LIGHT和LV-UbHBcAg-LIGHT转染以上293T细胞株,比较二者在各293T细胞株的转染率与DC-SIGN水平的关系;分别用LVDC-UbHBcAg-LIGHT和LV-UbHBcAg-LIGHT转染小鼠骨髓混合细胞,流式细胞仪比较两者对骨髓细胞中DC转染的特异性;检测DC-SIGN单克隆抗体阻断剂作用前后LVDC-UbHBcAg-LIGHT和LV-UbHBcAg-LIGHT对小鼠髓源性DC转染率的变化;构建含有荧光素酶报告基因的靶向慢病毒LVDC-luc和非靶向慢病毒LV-luc并于皮下免疫BALB/c小鼠,一个月后,活体成像检测发光信号在小鼠注射部位和体内脏器的分布情况。3.检测各组慢病毒促进DC成熟的能力;将负载不同慢病毒的DC分别与小鼠同源性T淋巴细胞共培养,检测各组HBV特异性的CD8+T细胞反应,流式检测各组细胞凋亡和周期,并探讨自噬通路相关蛋白、细胞凋亡及周期相关蛋白在T细胞激活中表达的变化以及自噬阻断对T细胞激活以及细胞凋亡、细胞周期的影响。4.将各组慢病毒分别免疫HBV转基因小鼠,检测各组小鼠体内HBV特异性CTL反应、血清HBsAg和HBV DNA水平、肝细胞中HBsAg和HBcAg的蛋白表达;检测自噬通路相关蛋白、凋亡和周期相关蛋白的表达及上述蛋白在CD8+T细胞内共定位和相互作用的关系,以探讨自噬促进T细胞激活的机制。结果:1.基因测序和Western blot证实LVDC-UbHBcAg-LIGHT构建成功。2.随着293T细胞中DC-SIGN蛋白水平的增高,LVDC-UbHBcAg-LIGHT的转染率也逐渐增高,而LV-UbHBcAg-LIGHT的转染率与DC-SIGN的表达无关;LV-UbHBcAg-LIGHT能高效转染小鼠骨髓细胞,但特异性转染DC的能力较低,LVDC-UbHBcAg-LIGHT虽转染骨髓细胞的能力较弱,但特异性转染其中DC的能力较强;单克隆抗体阻断剂封闭DC-SIGN后,LVDC-UbHBcAg-LIGHT对BMDC的转染率显著减低,而阻断剂对LV-UbHBcAg-LIGHT的转染率无显著影响;活体成像显示LVDC-UbHBcAg-LIGHT组小鼠的注射部位及体内任何脏器均检测不到发光信号,而LV-UbHBcAg-LIGHT组小鼠的上述部位可检测到不同强度的发光信号。3.LVDC-UbHBcAg-LIGHT转染DC后,DC表面激活标记物的表达以及IL-12p的分泌均明显高于LVDC-UbHBcAg转染组,而LVDC-UbHBcAg-LIGHT组和LV-UbHBcAg-LIGHT组之间无显著差异;不同慢病毒负载DC均可不同程度地刺激T细胞增殖,促进细胞因子的产生,增强CTL的杀伤活性;其中LVDC-UbHBcAg-LIGHT负载DC组对T细胞的以上激活作用均显著高于LVDC-UbHBcAg组,而LVDC-UbHBcAg-LIGHT负载DC组和LV-UbHBcAg-LIGHT负载DC组之间的差异无统计学意义;此外,自噬在激活的CD8+T细胞中被明显诱导,与此同时细胞凋亡显著减少,细胞大量进入S-期并进行大量增殖,HBV特异性T细胞反应均明显增强;自噬途径阻断后,凋亡和周期相关蛋白的表达迅速增高,细胞凋亡显著增多,细胞进入S-期受到阻滞,增殖能力减弱,HBV特异性T细胞反应均明显降低。4.不同慢病毒直接免疫HBV转基因小鼠后均能不同程度地诱导细胞因子的产生,增强特异性CTL杀伤活性,其中LVDC-UbHBcAg-LIGHT对以上T细胞的激活作用均明显高于其它组;LVDC-UbHBcAg-LIGHT能显著降低转基因小鼠肝组织HBsAg、HBcAg的表达以及血清HBsAg、HBV DNA水平;LVDC-UbHBcAg-LIGHT免疫小鼠的CD8+T细胞中凋亡和周期相关蛋白的表达显著降低,细胞增殖活性显著增强,而凋亡细胞的百分比则明显降低,对应T细胞免疫反应增强;激光共聚焦和免疫沉淀结果证实激活的CD8+T细胞中泛素、自噬受体p62与凋亡或周期蛋白以聚合物的形式存在。结论:重组慢病毒LVDC-UbHBcAg-LIGHT在体内和体外均能靶向转染小鼠DC,具有强大的诱导特异性CTL反应的能力,并可在HBV转基因小鼠体内产生较强的抗病毒效应;LVDC-UbHBcAg-LIGHT介导激活的CD8+T细胞中广泛诱导的自噬通过选择性降解周期和凋亡相关蛋白,从而抑制细胞凋亡,促进细胞大量增殖活化为具有杀伤效应的CTLs。
【图文】：

上海交通大学博士学位论文图 1-1 pLOV-UBC-Ub-HBcAg-EGFP-P2A-LIGHT-3FLAG 表达质粒结构示意图Fig1-1 The schematic diagram of pLOV-UBC-Ub-HBcAg-EGFP-P2A-LIGHT-3FLAG expressionvector3.2. 慢病毒表达质粒 pLOV-UBC-DC-SIGN-3FLAG 的结构示意图用 EcoRI 和 NheI 对质粒 H134 pLenti-Ubc-EGFP-3FLAG 进行双酶切，切掉其中的 EGFP 片段，以避免表达的绿色荧光蛋白对后续的病毒靶向性鉴定实验产生影响；然后将剩下的载体与经扩增、纯化的 Cd209a（即 DC-SIGN）基因片段进行连接，得到表达质粒 H4723 pLenti-Ubc-Cd209a-3FLAG（见图 1-2）。

图 1-3 H4738 pHCMV-SVG 包膜质粒结构示意图Fig1-3 The schematic diagram of pHCMV-SVG envelope vector3.4. 重组克隆菌落中阳性克隆的测序结果将 菌 落 PCR 阳 性 克 隆 送 测 序 ， 经 序 列 比 对 ， 插 入 目 的 基 因EGFP-P2A-Tnfsf14-3FLAG 及 DC-SIGN 的 序 列 正 确 ， H4725（ pLOV-UBC-Ub-HBcAg-EGFP-P2A-LIGHT-3FLAG ） 及 H4723（pLOV-UBC-DC-SIGN-3FLAG）构建成功，测序图分别见图 1-4 及图 1-5。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R512.62

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本文编号：2669008