结核分枝杆菌H37Rv感染THP-1源性巨噬细胞基因调控网络的构建与分析

发布时间：2020-05-22 14:57

【摘要】：背景及目的:2016年全球约170万人死于结核病(Tuberculosis,TB),超过因感染人类免疫缺陷病毒(HIV)而死亡的病人人数,结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)作为TB的病原体,再次成为了导致全球人类死亡的主要传染病因素。近年来,由于耐药结核分枝杆菌甚至多重耐药结核分枝杆菌的出现和快速传播,加之目前卡介苗(BCG)疫苗的保护力有限,使得TB疫情很难得到有效控制。基因芯片技术可以同时检测上千万个基因的表达,绘制全基因组表达谱,这一技术的产生拓展了生物学的研究方法,极大地推动了基因功能的阐明以及基因间相互作用的研究。本研究基于结核分枝杆菌H37Rv感染人急性白血病单核细胞(Human acute monocytic leukemia cell line,THP-1)源性巨噬细胞表达谱芯片,运用生物信息学的分析方法,构建H37Rv感染THP-1源性巨噬细胞基因调控网络,挖掘出与结核分枝杆菌感染过程相关的功能模块,并筛选出关键基因,对深入了解结核病的发病及宿主防御机制具有重要意义,并为更有效地诊断与治疗结核病提供了新视角。材料及方法:从NCBI的GEO Datasets数据库中获取结核分枝杆菌H37Rv感染人白血病单核细胞THP-1源性巨噬细胞模型的芯片数据集,使用R语言的limma包筛选出差异表达的基因,运用DAVID(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery)对差异基因进行功能注释分析(GO-Analysis)和信号通路富集分析(Pathway-Analysis),再整合转录调控元件数据库(Transcriptional Regulatory Element Database,TRED)分析差异表达的转录因子与基因的靶向关系,构建结核分枝杆菌H37Rv感染THP-1源性巨噬细胞转录因子-基因调控网络,进一步运用DAVID对网络调控图中的基因和转录因子(Transcription Factor,TF)进行功能注释分析以及疾病关联分析。进一步构建结核分枝杆菌H37Rv感染THP-1源性巨噬细胞的细胞实验模型,借助形态学分析方法、激光共聚焦显微镜和ELISA方法等验证模型构建成功与否,并通过qRT-PCR验证网络中重要节点基因(CYP19A1)和转录因子(NFKB1,STAT1,PPARG,CEBPB)的表达水平,最后对基因NFKB1,CEBPB和CYP19A1进行受试者工作特征曲线(ROC曲线,receiver operator characteristic curve)分析,确定其区分感染细胞与未感染细胞的特异性与灵敏度。实验结果:本研究收集到2个基因表达谱原始数据集,利用limma包筛选获得625个差异表达基因,其中427个基因表达上调,198个基因表达下调。对差异表达基因进行GO分析,得到在生物过程(Biologocal Process,BP)、细胞组分(Cellular Component,CC)和分子功能(Molecular Function,MF)分类中的基因条目分别为179、61和85条,如defense response to virus,response to virus,inflammatory response(BP);cytosol,cytoplasm,nucleoplasm(CC);chemokine activity,protein binding,ATP binding(MF)等。Pathway分析发现差异基因主要富集在Influenza A,Herpes simplex infection,NF-kappa B signaling pathway等47个条目。根据差异表达的8个转录因子(NFKB1,STAT1,PPARG,CEBPB,E2F2,STAT4,RELB,NFKB2),整合TRED数据库,建立了包含58个差异基因的转录因子-基因调控网络,其中转录因子NFKB1,STAT1,CEBPB和PPARG调控了大部分差异表达基因,网络中同时受三个以上转录因子调控的基因称为枢纽基因(Hub Gene),包括CYP19A1,IL6和IRF1,其中CYP19A1是被多个转录因子调控的基因。进一步分析网络中58个基因主要注释在inflammatory response、immune response、extracellular space、cytosol、protein binding、transcription factor activity,sequence-specific DNA binding等功能上,并与cancer、infection、immune、renal和reproduction等疾病相关。生物学验证方面,我们成功建立了结核分枝杆菌H37Rv感染THP-1源性巨噬细胞的细胞实验模型,使用qRT-PCR技术检测网络中重要节点基因(CYP19A1)和转录因子(NFKB1,STAT1,PPARG,CEBPB)的表达水平,结果发现,除转录因子STAT1外,基因CYP19A1和转录因子NFKB1,PPARG,CEBPB均上调表达,与从芯片数据分析出的基因表达趋势结果相一致,感染组中基因CYP19A1和转录因子NFKB1,CEBPB的表达与对照组相比有显著差异,具有统计学意义。ROC曲线分析NFKB1,CEBPB和CYP19A1发现曲线下面积(AUC)分别为0.832、0.816和0.710,表明基因能够较好区分感染与未感染细胞。结论:(1)构建了以NFKB1,STAT1,PPARG和CEBPB为主要转录因子的TF-mRNA基因调控网络,呈现出巨噬细胞免疫应答结核分枝杆菌感染过程中基因间相互作用及调控关系。(2)成功建立了结核分枝杆菌H37Rv感染THP-1源性巨噬细胞的细胞实验模型。(3)报道基因CYP19A1在巨噬细胞免疫应答结核分枝杆菌感染过程中的上调表达及其在负调控巨噬细胞趋化的潜在功能,为研究巨噬细胞-结核分枝杆菌相互作用影响提供新的线索。
【图文】：

|Log2FC|>1 的数据为本研究中的差异表达基因。图 2.1 筛选芯片关键词截图2.1.2.2 差异表达基因的聚类分析使用 R 语言 ggplot2 包对差异表达基因进行聚类分析，热图可以将差异表达基因具象化进行质量控制，然后将基因表达值进行聚类分析。颜色不同表示基因的表达量不同，红色代表上调基因，，颜色越深表示基因表达值越高，绿色代表下调基因，颜色越深表示基因表达值越低。聚类分析代码见附录。

第 2 章 结核分枝杆菌 H37Rv 感染 THP-1 源性巨噬细胞模型芯片收集与分析2.2.2 差异表达基因的的可视化分析使用 R 语言 ggplot2 包对两个芯片共同的 625 个差异表达基因进行聚类分析，结果如图 2.3（A）所示，0（黄色）代表感染组，1（蓝色）为对照组，由图可见，差异表达的基因可以很好的区分结核分枝杆菌感染组和对照组。用 R语言 ggplot2 包绘制两个芯片共同的 625 个差异基因火山图，如图 2.3（B）所示绿色代表下调大于 2 倍的基因，红色代表上调大于 2 倍的基因。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R52

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本文编号：2676169