乙肝病毒large S基因及其变异促进HCC发生发展的机制研究

发布时间：2020-06-08 14:32

【摘要】：研究背景:基于全球的肿瘤登记数据,肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的发病率在男性和女性肿瘤中分别位列第五位和第九位,而每年因HCC而死亡的患者,在男性和女性肿瘤中排列为第二位和第六位。中国每年新发HCC和因其死亡人数均约占到世界范围内的50%左右。我国HCC患者绝大部分是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)慢性感染导致的;而且HBV慢性感染人群基数庞大,这是引起HCC高发的最主要原因之一。HBV large S基因(preS1/preS2/S)编码了病毒颗粒的表面蛋白,是病毒感染肝细胞、机体抗原识别表位和引起HCC发生发展的关键影响因素。前期大量的流行病学数据显示,该基因片段preS区的相关变异是促进HCC发生发展的危险因素。但是何种preS变异序列,以及这些变异是通过何种机制导致了HCC的发生,目前尚无相关研究能够完全阐明。研究目的:证实影响HBV慢性感染患者发生HCC的危险因素,阐明何种HBV preS区的基因变异能促进HCC的发生;在体外实验中,发现这些变异序列所引起的癌症相关表型的改变和调控的下游基因与其作用机制;在体内实验中,验证large S序列及变异的致炎、致癌效果。为后续如何预防慢性HBV感染患者发生HCC和进行相应的治疗,提供理论依据。研究方法:应用纳入2114位HBV慢性感染者队列,设计特异性引物扩增患者外周血中HBV基因组preS区片段,采用sanger测序的方法,序列比对后鉴定相关preS变异。纳入患者人口学资料、临床一般信息和治疗信息等,采用COX单因素和多因素风险回归模型分析方法,促进HCC发生和患者肝病相关死亡的风险因素。应用HBV large S基因野生型和筛选出的三种变异型序列,构建相关慢病毒载体,转染HepG2细胞系;通过检测细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭、裸鼠皮下荷瘤等表型,观察相关基因序列对细胞恶性表型的影响。测定不同细胞内RNA表达谱芯片,比较分析large S基因及其变异调控的下游基因。通过实时荧光定量PCR(reverse transcription quantitative PCR,RT-qPCR)、免疫印迹实验(Western Blot,WB)等分子生物学实验研究其可能的调控机制。将相关基因序列构建Sleeping Beauty相关载体,用尾静脉注射的方式表达于小鼠肝脏。阐明变异型large S基因所致小鼠肝脏炎症状态和肝细胞癌的发生情况。通过小鼠肝脏RNA表达谱芯片的测定,比较分析large S基因及相关变异在动物体内的调控的基因及参与的信号通路。后续相关分子的免疫组化等实验来验证靶分子的表达水平,进一步验证large S基因及其变异调控的作用机制。研究结果:该研究第一部分,人群队列的研究结果显示,2114例HBV慢性感染患者队列,随访的中位时间为8.92年,总共随访18406人年。在随访期间内,共有209例患者发生HCC,发生率为9.89%(209/2114)。经COX回归分析后,我们得出男性患者、高年龄患者、肝硬化、HBV C2基因亚型、未使用抗病毒治疗、高直接胆红素(7mmol/L)、甲胎蛋白阳性、低白蛋白水平(35g/L)、低血小板计数(100×10~9 g/L)是促进HCC发生的危险因素(P0.05)。此外,HBV基因组preS区中C3116T和T31C突变促进了HCC的发生发展。在HBV慢性感染者体内,C2为主要基因亚型(73.1%),由C2基因亚型所引起的HCC发生,占83.3%(125/150)。HBV C2基因亚型相关preS变异,如G2950A、G2951A、A2962G、C2964A、A3054T、C3063G、T3069G和A3120T,均促进了HCC的发生。preS区相关变异的组合,如G2950A/G2951A/A2962G/C2964A(mutation 1),促进了HCC的发生(HR 2.51,95%CI,1.10-5.74;P=0.030);联合突变C3116T/T31C(mutation 2)变异也增加了HBV慢性感染患者HCC的发病风险(HR1.57,95%CI,1.07-2.31;P=0.022)。此外,preS2 deletion(5bp)在使用抗病毒治疗的人群中,促进了HCC发生(HR 2.81,95%CI,1.27-6.22;P=0.011)。课题第二部分,体外实验结果显示,HBV large S基因deletion序列较wild type序列显著提高了细胞增殖能力、软琼脂克隆能力和裸鼠皮下荷瘤能力(P0.05)。但三种变异型large S序列(mutation 1、mutation 2和deletion)对细胞迁移、细胞侵袭等细胞转移运动能力没有提升,差异无统计学意义(P0.05)。在转染目的基因后,mRNA表达谱芯片结果显示,野生型large S基因主要影响了细胞内基因转录、细胞周期和促进细胞凋亡等生物学进程。Mutation 1、mutation 2和deletion序列与wild type基因比较后发现,三种变异均降低了细胞凋亡和细胞内免疫相关基因的表达,并上调了癌症相关的信号通路。基因定量的结果也证实了促进凋亡的相关基因OLR和PMAIP1在变异组中低于wild type组,且抑制凋亡基因BIRC3和BIRC2则在变异组中高于wild type组。癌症相关基因的表达水平,如STAT3信号通路在deletion组中,其表达水平较wild type组高(P=0.027)。Western blot实验的结果显示,STAT3分子的表达水平在三种变异组中高于野生型large S组,但磷酸化后的p-STAT3蛋白表达量在各组间未见明显差异。在STAT3分子抑制剂stattic作用下,各组间的细胞增殖趋于一致。而在STAT3信号通路激动剂IL-6作用下,各组间的细胞增殖能力有显著的提高,并增大了组间差异。相关交互作用分析显示,三种变异型large S基因与炎症因子,协同通过IL-6/STAT3信号通路促进了HepG2细胞的增殖。通过构建好的小鼠模型,发现3种变异型large S基因导致小鼠的生存期受到不同程度的降低。三种变异型基因(mutation 1、mutation 2和deletion)引起小鼠肝脏肿瘤的发生率,较wild type有不同程度的提高,分别为36.4%(4/11)、57.1%(4/7)、66.7%(4/6),(P_(trend)=0.023)。肝脏实物图和HE染色镜下可见表达HBV large S基因的小鼠肝脏炎症状态明显,肝细胞呈现出水肿、变性;在严重挤压状态下,肝脏特征性结构不明显。肝癌相关特异性分子CK18、细胞增殖相关蛋白Ki-67和PCNA的免疫组化评分,在mutation 1、mutation 2和deletion组中均较vector组或wild type组显著提高(P0.05)。小鼠肝脏的mRNA表达谱芯片结果显示:野生型large S基因的表达,调节了细胞凋亡、免疫应激,以及癌症相关相关信号的激活。Mutation 1、mutation 2和preS2 deletion序列的表达后与野生型large S基因比较,这些相关均进一步的上调了小鼠肝脏细胞内炎症与癌症相关基因集,以及癌症相关信号通路的激活。小鼠外周血中相关分子ELISA结果显示,炎-癌转化相关细胞因子IL-5、IL-6和IL-12均表现为,wild type组中的表达较vector组高,而三种变异型组较wild type组高。此外,表达三种变异型large S基因的小鼠肝脏中,STAT3和p-STAT3分子的表达评分均较vector组与wild type组高,差异有统计学意义(P0.05)。上述结果表明,三种large S基因变异,尤其是preS2 deletion可与小鼠体内的炎症状态,共同通过激活IL-6/STAT3相关信号通路,进而促进了HCC的发生发展。研究结论:本课题通过队列研究证实了众多临床指标和HBV基因preS区相关突变是慢乙肝患者发生HCC的危险因素。进一步研究发现相关preS区的组合突变(G2950A/G2951A/A2962G/C2964A,C3116T/T31C和preS2 deletion),具有促进慢性HBV感染者发生HCC的作用。在体外实验中,证实三种变异型large S基因,尤其是preS2 deletion序列可通过上调STAT3分子的表达,激活癌症相关信号通路,促进了HCC的发生发展。小鼠模型中,也证实了三种变异型large S基因的表达具有促进小鼠肝脏炎症、癌症的作用。本课题充分解释了HBV large S基因preS区相关突变促癌发生发展的作用机制,为防控HCC的发生,提供了新的思路。
【图文】：

流程图,队列,流程图,患者

军医大学博士学位论文队列的构建：3304 例慢性 HBV 感染患者在初步纳入本队列后，，排除 512 例患有失代偿性不符合该研究的肝病患者； 86 例在电话确认后拒绝参加该研究的患者；存在其它肝炎病毒混合型感染；117 例未收集到生物样本（即足够用于相关清）。在时间节点 2008 年 1 月后，即开始进行队列的患者初次确认与随访，86 例在初次随访就联系不上的患者；289 例未完成持续 48 周的抗病毒治疗或方案频繁更改、抗病毒治疗过程不明确；23例患者在纳入队列后1年内发生H上述排除标准和随访开始后排除的患者，共有 1190 例患者被排除在本队列最终剩余 2114 例患者符合本项目研究（图 1-1）。

联合突,患者,肝病,抗病毒

- 35 -图 1-2. preS 区联合突变 G2950A/G2951A/A2962G/C2964A 在 C2 基因型 HBV 慢性感染中对 HCC 发生和患者肝病相关死亡的影响（a.联合突变 mutation 1 在 CHB 患者中促进 HCC 发生；b. 联合突变 mutation 1 促进 CHB 患者死亡情况；c. 联合突变 mutation 1 在非抗病毒患者中影响 HCC 发生情况；d. 联合突变 mutation 1影响非抗病毒患者的死亡情况；e. 联合突变 mutation 1 在抗病毒患者中影响 HCC 发生情况；f. 联合突变 mutation 1 影响抗病毒患者的死亡情况。）
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R512.62;R735.7

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