胆汁酸受体FXR在HBV感染中的作用机制研究

发布时间：2020-06-30 00:31

【摘要】：背景乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)属于嗜肝DNA病毒科,为部分双链环状DNA。乙型肝炎病毒的感染是一个全球公共卫生问题,目前有20亿人口感染HBV,其中2.4亿人为慢性感染者。乙型肝炎病毒感染机体后,可引起肝炎、肝纤维化甚至是肝癌。现有的干扰素类药物和核苷类似物无法完全清除乙型肝炎病毒DNA,因此,根治HBV仍然是临床医生面临的一项重要挑战。法尼酯X受体(Farnesoid X receptor,FXR)是胆汁酸受体,属于核受体超家族中的一员,法尼酯X受体FXR在胆汁酸、胆固醇、甘油三酯及葡萄糖代谢方面扮演着重要角色。HBV感染可导致体内胆汁酸水平升高,但胆汁酸及胆汁酸受体FXR在HBV感染中的病理生理作用仍不清楚。目的探讨胆汁酸及胆汁酸受体FXR在乙型肝炎病毒感染中的作用机制,从而为乙型肝炎病毒感染的治疗提供实验依据。方法(1)收集HBV感染者肝脏组织标本及相关临床资料,HE染色和免疫组织化学技术检测肝脏HBsAg、HBcAg及CYP7A1的表达,分析HBV感染者胆汁酸与肝脏病理变化之间的关系;(2)在HepG2细胞中,转染pAAV/HBV1.2质粒,pFXR质粒,转染后24小时加CDCA及FXR拮抗剂Z-Guggulsterone处理24小时,收集胞内蛋白及细胞上清液,ELISA检测HBsAg和HBeAg表达;(3)在HepG2细胞中,转染pGL3-SP1或pGL3-SP2、pFXR质粒,同时转染内参质粒pRL-TK,转染24小时后加CDCA,48小时后检测荧光素酶活性;(4)在HepG2细胞中,转染pAAV/HBV1.2质粒或pAAV/HBV1.2 HBeAg-null质粒,pFXR质粒,转染24小时后加CDCA刺激48小时,提取细胞内总RNA,RT-PCR检测相关分子表达;(5)选取6-8周龄SPF级的C57BL/6及FXR~(-/-)雄性小鼠,每只小鼠高压尾静脉注射10μg pAAV/HBV1.2质粒,构建HBV小鼠模型,不同时间点采集小鼠血清标本,ELISA检测HBV小鼠血清HBsAg、HBeAg、HBcAb、IL-10水平;提取HBV小鼠血清病毒DNA,RT-PCR技术检测血清病毒DNA含量;提取HBV小鼠肝脏蛋白,ELISA检测HBV小鼠肝脏中HBsAg、HBeAg表达情况;免疫组织化学技术检测HBV小鼠肝脏内HBcAg表达情况;HBV小鼠肝脏组织经超声破碎匀浆后提取总RNA,RT-PCR技术检测肝脏固有免疫分子等相关基因转录水平变化;HBV小鼠肝脏经一系列方式处理后做HE染色,从形态学方面来观察小鼠肝脏损伤程度;取HBV小鼠血清检测谷丙转氨酶ALT活性变化;(6)数据使用SPSS 19.0软件进行独立样本t检验(t-test)统计分析,使用Graph Pad Prism5.0软件作图,以P0.05为差异有统计学意义。结果(1)收集临床HBV感染者的肝脏进行免疫组织化学染色以检测其肝脏中HBsAg及CYP7A1的表达,对HBsAg及CYP7A1的免疫组织化学染色结果进行0-5分评分,根据HBV感染者肝脏HBsAg免疫组织化学结果评分及血清总胆汁酸水平做相关曲线分析,结果显示:HBV感染者肝脏内HBsAg的表达与血清总胆汁酸水平呈正相关,且HBsAg与CYP7A1也呈正相关;HBV感染患者引起的肝脏毛玻璃样病变与胆汁酸有关;(2)HepG2细胞转染pAAV/HBV1.2和pFXR质粒24小时后,加入CDCA及FXR拮抗剂Z-Guggulsterone作用24小时,ELISA实验结果表明FXR拮抗剂Z-Guggulsterone可以抑制HBsAg及HBeAg的表达(P0.05);(3)在HepG2细胞中,转染pGL3-SP1或pGL3-SP2、pFXR质粒,同时转染内参质粒pRL-TK,转染24小时后加CDCA,48小时后检测荧光素酶活性,结果显示:CDCA通过FXR使pre-S1启动子的活性升高1.7倍,CDCA通过FXR使pre-S2启动子的活性升高1.4倍(P0.05);(4)HepG2细胞转染pAAV/HBV1.2和pFXR质粒24小时后,加入CDCA刺激48小时,RT-PCR实验结果表明FXR+CDCA组固有免疫分子TLR2的表达下降,同时伴有TNFα表达下降和ATF6上升(P0.05);胞内和细胞上清中病毒DNA的RT-PCR检测结果显示:转染pFXR并且加CDCA处理后,细胞上清中的病毒DNA含量下降,而胞内病毒DNA含量上升(P0.05)。HepG2细胞转染pAAV/HBV1.2 HBeAg-null和pFXR质粒24小时后,加入CDCA刺激48小时,RT-PCR实验结果表明:FXR+CDCA组固有免疫分子TLR2表达不再下调,TNFα表达下降,ATF6表达上升;(5)与C57BL/6小鼠相比,ELISA实验结果表明FXR~(-/-)模型鼠的血清及肝脏中HBsAg、HBeAg的表达下降;免疫组织化学染色结果显示FXR~(-/-)模型鼠肝脏中HBcAg的表达下降;ELISA实验结果显示FXR~(-/-)模型鼠血清中的HBcAb水平下降,然而尾静脉高压注射后的C57BL/6小鼠及FXR~(-/-)小鼠血清中的细胞因子IL-10无差异;RT-PCR检测小鼠肝脏中固有免疫分子及相关炎症分子的结果表明:FXR~(-/-)模型鼠肝脏中固有免疫分子TLR2表达升高,TNFα和IFNγ的表达均下降;同时尾静脉高压注射pAAV/HBV1.2质粒后的FXR~(-/-)小鼠血清病毒DNA的含量低于C57BL/6小鼠血清病毒DNA含量;HE染色结果提示:C57BL/6小鼠与FXR~(-/-)小鼠肝组织在形态学方面无显著差异;血清转氨酶结果显示:正常的C57BL/6小鼠和FXR~(-/-)小鼠血清中的ALT无差异,而尾静脉高压注射pAAV/HBV1.2质粒后第1天,C57BL/6小鼠与FXR~(-/-)小鼠血清转氨酶急剧升高,但在尾静脉高压注射pAAV/HBV1.2质粒后第7天,C57BL/6小鼠与FXR~(-/-)小鼠血清转氨酶基本恢复正常。结论(1)在HBV感染FXR~(-/-)小鼠模型,HBsAg、HBeAg及HBcAg表达下降;(2)胆汁酸通过FXR促进HBeAg的表达,从而抑制固有免疫分子TLR2;(3)胆汁酸通过FXR促进HBV复制,但抑制HBV病毒粒子的释放;(4)HBV感染患者引起的肝脏毛玻璃样病变与胆汁酸有关。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R512.62
【图文】：

肝脏,免疫组织化学染色,肝内,HE染色

图 3-1 肝脏毛玻璃样变性与肝内 HBsAg 有关注：图 3-1 是 HBV 感染者肝脏 HE 染色及 HBsAg 免疫组织化学染色结果，图 a、均为放大 200 倍。 HBV 感染者肝脏中 HBsAg 与血清总胆汁酸含量关系医院收集的 HBV 患者肝脏石蜡切片（N=12）行免疫组织化学 HBsAg免疫组织化学 HBsAg 染色结果进行 0-5 分评分。对 HBV 患者的免疫组分和血清总胆汁酸含量做相关曲线，如图 3-2，结果显示：HBV 患者血清总胆汁酸含量呈正相关，P = 0.0012，差异有统计学意义。

感染者,血清总胆汁酸,肝内,肝脏

26图 3-2 HBV 感染者肝内 HBsAg 与血清总胆汁酸含量呈正相关注：图 3-2 是对 HBV 感染者肝脏 IHC-HBsAg 评分和血清总胆汁酸含量做相关曲线的结果。3.3 HBV 感染者肝脏中 HBsAg 与肝内 CYP7A1 呈正相关对从医院收集的HBV患者肝脏石蜡切片（N=12）行免疫组织化学HBsAg和CYP7A1染色，在镜下对免疫组织化学 HBsAg 和 CYP7A1 染色结果进行 0-5 分评分，分析 HBV感染者肝内 HBsAg 与肝内 CYP7A1 的关系，结果显示：HBV 感染者肝脏 HBsAg 和CYP7A1 呈正相关。图 3-3 HBV 感染者肝脏中 HBsAg 与肝内 CYP7A1 呈正相关注：图 3-3 是 HBV 感染者肝脏 HBsAg、CYP7A1 的免疫组织化学染色结果，图 a、b、c、d 均为放大 200 倍。

【参考文献】