乙肝表面抗原和表面抗体双阳性的流行率及突变分析

发布时间：2020-07-10 01:07

【摘要】：研究背景乙型肝炎病毒(HBV)是引起乙型肝炎的病原体,在全球范围内广泛流行,据估算大约有20亿人口被感染,其中接近3亿为慢性的乙肝病毒携带者。乙肝病毒表面抗体的出现表明患者曾经接种过乙肝疫苗,或者曾经感染过乙肝病毒,现处于感染的恢复期和具有一定的免疫力。回顾既往研究,曾有报道指出,在慢性乙肝病毒携带者中,可在患者血清中同时检测到乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝表面抗体(HBsAb),全球报道出现双阳性的概率约为2.43%-8.90%~([1-7])。有报道称HBV表面抗原和抗体的双阳性是由于HBV突变引起,这种突变可能是由于免疫逃逸所造成的选择性作用~([4,6,8-11])。然而,也有研究者发现HBsAb阳性与阴性的乙肝患者中发生HBsAg突变的情况没有显著性差异,因此认为双阳性可能与患者同时感染不同亚型的HBV有关联~([12])。因此HBsAg和HBsAb双阳性的潜在机制仍然是模糊和有争议的。研究目的分析2014-2016年间,广州地区乙型肝炎表面抗原和表面抗体双阳患者的流行率及其血清学特征,分析出现双阳性流行率差异的影响因素。并评估中国慢性乙肝患者S基因主要亲水区域突变与表面抗原和表面抗体双阳性血清学资料之间的关系,探究其发生的可能机制及临床意义,对慢性乙型肝炎的诊断、治疗方案及病情评估具有重要意义。研究方法1.利用雅培I2000化学发光微粒免疫自动检测平台对HBV血清学标志物五项指标进行检测,患者的五项乙肝标志物为HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb。标本来源为2014-2016年间,在广州医科大学附属第一医院就诊的慢性HBV感染患者。采用统计软件SPSS 22.0对结果进行统计、分析,得出广州地区乙型肝炎表面抗原和表面抗体双阳患者的流行率。2.采用巢式PCR对2015年的两组Ⅰ组(44例)HBsAg(+)/HBsAb(+),Ⅱ组(88例)HBsAg(+)/HBsAb(-)共132例患者的血清病毒DNA进行扩增,通过直接测序技术检测乙肝病毒的S基因序列。并用序列比对软件MEGA6、统计软件SPSS 22.0对S基因突变结果进行分析。研究结果1.本研究统计了2014-2016年13,369名HBsAg阳性病人,HBsAg和HBsAb双阳患者559名,流行率分别为4.52%、4.02%和4.04%;HBsAg和HBsAb双阳病人中,男性患者所占比例更高,主要表现为“HBsAg(+)、HBsAb(+)、HBeAg(-)、HBeAb(+)、HBcAb(+)”模式,HBeAb阳性的病人出现的概率更大,占68.34%,并且以低浓度HBsAb10.00~100.00 mIU/ml为主,占89.44%。2014年、2015年和2016年双阳性患者的年龄、性别差异有统计学意义(p0.05),HBeAg阳性率差异无统计学(p0.05),其中,2015年的平均年龄显著高于2014年和2016年,2015年的男性比例显著低于2014年和2016年。2.在两组患者中,HBV基因型主要为B型(56.82%)和C型(43.18%);两组患者的年龄、性别和HBV基因型分布,差异没有统计学意义(p0.05)。但是Group I患者的HbeAg阳性率明显高于Group II,差异有统计学意义(p0.001)。I组患者中以低浓度HBsAb 10.00~100.00 mIU/ml为主,占86.36%;主要亲水区域(MHR)发生突变的比例为59.09%;I组患者MHR每100个氨基酸的变异数约为II组患者的7.1倍(2.50vs0.35,p0.001),至少发生两个氨基酸突变的有16名患者,其中12名患者(31.82%,12/44)来自I组,只有2名患者(2.27%,2/88)来自II组(p0.001);突变主要发生在“α”决定簇(3.41vs0.90,p0.001)。此外,两组还存在下列差异有统计学意义,MHR1(2.81vs0.05,p0.001)、MHR3(4.38vs1.06,p0.001)、MHR4(2.05vs0.68,p0.05)、MHR5(1.24vs0,p0.001)。但是两组在MHR2差异没有统计学意义(2.27vs0.57,p=0.099)。两组患者的点突变也存在显著差异,I组中突变点主要是s101Q、s114S、s120P、s126T/I、s129Q、s131T、s133M和s145G,突变频率更高且差异有统计学意义的是sQ101K、sT131N和sM133L(p0.05)。研究结论1.广州地区HBsAg和HBsAb双阳性的流行率为4.18%。HBsAg与HBsAb双阳模式出现在男性患者的概率更高,HBeAg转换为HBeAb其传染性并未减弱;以低浓度HBsAb为主,可能说明双阳患者的HBsAb是在感染期间形成的。2.在两组患者中,Group I组患者的HbeAg阳性率更高,说明其传染性比Group II组更强;但是ALT水平低,可能说明双阳患者对机体的影响是长期作用的结果;I组发生S基因突变的频率更高,提示S区基因尤其是“α”决定簇的突变造成了双阳的发生;突变主要位于“α”决定簇的第1环(MHR3),可能说明HBV突变不是受到人工主动免疫和/或者人工被动免疫、或者接受核苷类似物治疗的影响,而是患者在感染期间形成的HBsAb对乙型肝炎病毒长期的筛选压力致使HBV选择免疫逃逸突变引起的,并最终导致HBsAg与HBsAb双阳性的出现。
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R512.62
【图文】：

乙肝病毒,基因结构,基因组

前言为 C 基因（549bp）和前 C 基因，C 基因编码 HBcAg，前 C 基因编码 HBeAg；P（2496bp）在所有开发阅读框最长，大概占基因组 75%以上，编码乙肝病毒 DNA聚酶；X 区（462bp）编码 X 蛋白。这 4 种 mRNA 相互重叠并且终止于同一个olyA 位点区，其中 3.5 kb 的转录产物可以作为 HBV 的前基因组 RNA 通过逆转生成整个的 HBV 基因组，即 cccDNA。

乙肝表面抗原,抗体,浓度,表面抗体

表 3 2014-2016 年乙肝表面抗原抗体双阳病人乙肝 e 抗原和 e 抗体血清学分析阳性模式例数构成比 %1235 133 23.79%（133/559）1245 382 68.34%（382/559）125 44 7.87%（44/559）备注：1、2、3、4、5 分别代表 HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb 和 HBcAb2.3 乙肝表面抗原和抗体双阳性患者不同的 HBsAg 和 HBsAb 浓度组别分析双阳性不同的表面抗原和表面抗体浓度组别主要有 3 种，分别是 A 组、D组和 G 组。以低浓度 HBsAb 10.00～100.00 mIU/ml 为主，即(A+D+G)占89.44%(500/559) ；其次为 HBsAg 0.05 ～ 10.00 mIU/ml ，即 (A+B+C) 占46.87%(262/559)；HBsAg10.00～250.00 mIU/ ml，(D+E+F)占 28.80%(161/559)；HBsAg≥250 mIU/ ml，即(G+H+I)占 24.33%(136/559)。但是高滴度 HBsAb≥1000mI U/ml 所占比例最少，即(C+F+I)仅占 0.36%(2/559)，见图 2。

电泳图,乙肝表面抗原,组合分析,抗体

HBsAg10.00～250.00 mIU/mL，即(D+E+F)占29.55%；高浓度HBsAg≥250 mIU/mL，即(G+ H +I)占43.18%；高浓度的表面抗体HBsAb≥1 000 mIU/mL，即(C + F + I)没有在此次实验中出现，见图3。图 3 乙肝表面抗原和抗体双阳性不同的 HBs Ag 和 HBsAb 浓度组合分析3.5 PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果第一轮 PCR 扩增片段为 1602bp；第二轮 PCR 扩增片段为 836bp，见图 4。图 4 乙肝表面抗原和抗体双阳性 PCR 扩增产物电泳图图注：M：Marker(DL2000) 1：第一轮 PCR 片段（S 基因区） 2：第二轮 PCR 扩增（S 基因）3.6 HBV的主要亲水区域(MHR)内部的氨基酸突变（附图1）I组HBsAg(+)/HBsAb(+)和II组HBsAg(+)病毒株的主要亲水区域（MHR）内部的氨基酸（aa）突变方面有明显的差异，I组患者MHR的变异数约为II组患者的7.1

【参考文献】