实时荧光定量PCR诊断马尔尼菲青霉病方法的建立及其初步评价

发布时间：2020-07-10 04:54

【摘要】：目的建立马尔尼菲青霉病（Penicilliosis marneffei，PSM）快速、敏感、特异的实时荧光定量PCR （real time quantitative PCR，qPCR）方法，并对方法科学性进行评价。方法从Genebank上下载马尔尼菲青霉（Penicillium marneffei，PM）ITS（Internal Transcribed Spacer)区序列，使用Clustalx和BioEdit软件进行比对，获取PM最保守的区域序列。参考ABI Primer Express3.0软件工作原理，手工设计实时荧光定量PCR引物和TaqMan探针，并使用BLAST等加以验证。提取PM标准株FRR2161基因组DNA，采用普通PCR的方法对其进行扩增特异性片段，扩增产物回收纯化后与pEASY-T5Zero vector连接成重组质粒，转化到Trans1-T1感受态细胞（大肠杆菌），经基因序列分析方法鉴定重组质粒。培养大肠杆菌，提取重组质粒，根据重组质粒的光密度（OD）值计算出重组质粒的拷贝数，10倍梯度稀释后作为实时荧光定量PCR的标准品。应用设计的引物和探针初步建立实时荧光定量PCR检测方法，探索最佳反应体系。建立该反应体系的标准曲线，在不同时间、不同仪器进行批内、批间重复4次实验，评价该体系的最低检测限(limit of detection，LOD)、检测下限、线性范围、重复性等指标。分别提取PM（5株临床分离株）、健康人血清、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、米曲霉、黑曲霉、土曲霉、新生隐球菌、不规则根毛霉、卷曲毛霉、米根毛霉、尖端赛多孢子菌的基因组DNA，验证其诊断特异性。收集PSM患者血清标本，提取高质量真菌DNA，以之为模板，通过qPCR手段检测标本中的真菌DNA载量，评价该诊断方法的科学性。结果成功设计PM的特异性引物探针，扩增曲线呈典型“S”形。在最佳反应体系下，5株临床分离株PM基因组DNA的qPCR反应体系能进行特异性扩增，而含健康人血清、侵袭性曲霉病患者血清、播散性隐球菌病患者血清和上述常见病原细菌、真菌的基因组DNA的体系均不能扩增。在10～1×107拷贝数之间的不同底物浓度与Cq值之间具有良好的线性关系，相关系数（R2）均在0.99以上，斜率在-3.3左右。反应体系检测的灵敏度为5～10拷贝数，所有反应体系稳定性、重复性好，批内、批间重复4次实验，所得每一种反应体系Cq值批内、批间的变异系数均小于5%。所建立的反应体系对临床分离菌株检测的结果阳性率为100%，并且无交叉反应发生。55例PSM患者血清qPCR均阳性，Cq值在28.39～39.65之间。结论成功设计了特异性检测PM的引物、探针，并建立了实时荧光定量PCR检测体系，临床分离的5株PM全部检出，与临床其他常见的病原细菌、真菌及人基因组DNA无交叉反应。实验建立的qPCR检测体系稳定、可靠，有助于早期、特异地诊断PSM。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R756

【参考文献】