Gal-9对HIV-1感染者slanDC功能的影响

发布时间：2020-07-25 12:13

【摘要】：目的:slanDC是特异性的表达6-磺基N-乙酰乳糖胺(6-sulfo LacNAc,slan)的树突状细胞(Dendritic cells,DC),是DC的新亚群,具有很强的抗原递呈功能,在启动T细胞应答、活化NK细胞分泌细胞因子及诱导ADCC效应。HIV-1感染时slanDC数目增加,且活化水平增高。半乳糖凝集素-9(Gal-9)是具有嗜酸性粒细胞趋化活性的β半乳糖苷结合蛋白,是半乳糖凝集素家族成员之一,在病毒感染、自身免疫性疾病、肿瘤等疾病中发挥作用。Tim-3是Gal-9的主要受体,Gal-9/Tim-3信号通路在调节天然免疫反应及适应性免疫反应中发挥重要作用。slanDC是否表达Gal-9、Tim-3以及HIV-1感染时slanDC表面Gal-9、Tim-3的变化仍需要进一步研究。研究发现,急性HIV-1感染者,慢性HIV-1感染者,接受ARV治疗者、精英控制者血浆Gal-9水平高于未感染者,与病毒载量、疾病进展、治疗与否密切相关。体外研究发现Gal-9对DC成熟功能、分泌细胞因子及迁移功能有影响。人重组Gal-9可上调人单核细胞源性树突状细胞(Monocyte-derived dendritic cells,moDC)表面共刺激分子CD40、CD54、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达,促进moDC成熟,上调IL-12的分泌;人重组Gal-9还可与小鼠骨髓来源的树突状细胞(Bone marrow-derived dendritic cells,BMDC)表面Tim-3作用诱导BMDC成熟,促进小鼠心脏移植排斥反应。除了促进成熟功能外,重组Gal-9可抑制BALB/c小鼠BMDCs成熟、活化及Th2相关的促炎性细胞因子的分泌。slanDC是外周血DC的主要成员,且HIV-1感染时slanDC数目增加,已有前期研究表面Gal-9可影响moDC、BMDC的成熟、分泌细胞因子功能,那么HIV-1感染时Gal-9是否可通过影响slanDC表面CD40、CD80、CD83的表达影响slanDC成熟以及分泌细胞因子的功能,目前尚未见报道。除了slanDC外,还可根据DC表型及功能的不同,将DC分为髓系来源的树突状细胞(myeloid Dendritic Cells,mDC)和淋巴系来源的类浆样树突状细胞(plasmacytoid Dendritic Cells,pDC)。已有研究发现,HIV-1感染者mDC、pDC胞内存在大量的Gal-9,slanDC表面、胞内Gal-9的表达也有待于进一步研究。研究方法:1、研究对象。本研究选取了HIV-1感染者25例,均接受治疗,均来自中国医科大学附属第一医院红丝带门诊,经免疫印迹试验确认为阳性。健康对照组39例,HIV-1抗体阴性,无免疫系统疾病,未暴露于HIV-1的正常人。纳入本课题研究的所有患者均签署了知情同意书,并通过了中国医科大学附属第一医院伦理委员后批准。2、用密度梯度离心分离法提取外周血单个核细胞(PBMC),并计数。取1×10~6细胞检测slanDC、mDC、pDC细胞表面Gal-9及Tim-3的表达,取1×10~6细胞用于破膜及破核检测slanDC、mDC、pDC胞内Gal-9的表达。取4×10~6细胞用于检测人重组Gal-9对slanDC表面Tim-3、CD40、CD80及CD83表达的影响。取6×10~6细胞用于检测人重组Gal-9对slanDC细胞因子IL-12分泌的影响。3、检测slanDC、mDC、pDC表面Gal-9、Tim-3的表达。按照BD公司细胞表面染色说明书操作,用LSRⅡ流式细胞仪检测slanDC、mDC、pDC表面Gal-9、Tim-3的表达。5、检测slanDC、mDC、pDC胞内、核内Gal-9的表达。避光染表面,结束后,破膜、破核30min,染slanDC、mDC、pDC胞内、核内分泌的Gal-9,用LSRⅡ流式细胞仪检测slanDC、mDC、pDC胞内、核内Gal-9的表达。5、人重组Gal-9对slanDC成熟功能及Tim-3表达的影响,设立3组,分别是空白对照组、阳性对照组、加重组Gal-9组。每管加入R10培养基500ul,加入LPS 500ug/ml、Gal-9 10ug/ml,混匀后,放入37℃、5%CO2培养箱中培养40小时。培养结束后,对slanDC做表面染色,结束后应用LSRⅡ检测slanDC成熟功能及Tim-3表达的影响。6、人重组Gal-9对slanDC分泌细胞因子的影响,取0.5×10~6/管PBMC,分别是空白对照组、阳性对照组、加重组Gal-9组。每管加入R10培养基500ul,加入LPS 500ug/ml、Gal-9 10ug/ml,放入37℃、5%CO2培养箱中培养16小时。培养结束后对slanDC做表面染色,4℃避光染色30min,离心,4℃避光破膜30min,结束后,加入1ml/管破膜洗液离心,重复2次。染slanDC胞内分泌的IL-12,4℃避光染色30min。结束后,应用LSRⅡ检测人重组Gal-9对slanDC分泌细胞因子的影响。7、统计数学分析。应用Graphpad7.03、SPSS软件包进行统计分析和图形制作,不同组之间t检验,P0.05为有统计学意义。结果:1、HIV-1感染者、健康对照组slanDC表面、胞内均表达Gal-9,且胞内Gal-9的表达水平均较表面表达水平高;HIV-1感染者slanDC表面Gal-9的表达水平较健康对照组高;HIV-1感染者slanDC胞内Gal-9的表达水平较健康对照组低。2、HIV-1感染者、健康对照组slanDC表面均表达Tim-3,HIV-1感染者slanDC表面Tim-3的表达水平较健康对照组低。重组Gal-9、LPS均使HIV-1感染者slanDC表面Tim-3的表达水平增加。3、HIV-1感染者slanDC表面CD40、CD80、CD83的表达水平较健康对照组slanDC表面CD40、CD80、CD83的表达水平低。4、HIV-1感染者slanDC分泌细胞因子IL-12较健康对照组slanDC分泌的细胞因子IL-12水平低。5、重组Gal-9使HIV-1感染者slanDC表面CD40、CD80、CD83的表达水平下降。6、重组Gal-9、LPS使HIV-1感染者slanDC分泌细胞因子IL-12下降。7、健康对照组、HIV-1感染者mDC、pDC表面、胞内均表达Gal-9,且胞内表达水平较表面表达水平高,破膜、破核后Gal-9表达水平无明显变化。8、HIV-1感染者、健康对照组mDC表面均表达Tim-3,且HIV-1感染者mDC表面Tim-3的表达水平较健康对照组呈下降趋势;HIV-1感染者、健康对照组pDC表面均表达Tim-3,且HIV-1感染者pDC表面Tim-3的表达水平较健康对照组下降;HIV-1感染者、健康对照组mDC表面Tim-3的表达水平较slanDC、pDC高;HIV-1感染者、健康对照组slanDC表面Tim-3的表达水平较pDC高。结论:HIV-1感染者slanDC表面Gal-9的表达增加,胞内Gal-9的表达降低。HIV-1感染者slanDC表面Tim-3的表达降低,重组Gal-9可使HIV-1感染者slanDC表面Tim-3的表达水平增加。除此之外,重组Gal-9还可使HIV-1感染者slanDC表面CD40、CD80、CD83的表达水平及slanDC分泌细胞因子IL-12的水平下降,抑制slanDC的成熟及分泌细胞因子功能。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R512.91
【图文】：

加入到 Ficol 液面上，室温，400g，升速 5/降速 0，离心 30min。从上到下分为 4 层：血浆、PBMC 层（Buffy Coat）、淋巴细胞及粒细胞层。将移液管尖端固定在 PBMC 层上方一点，将 PBM个新的 50ml 离心管中，加 PBS 至 45ml。室温，300g，升/降速均为离心结束后，弃上清于高压灭菌桶中，重悬沉淀细胞，平均分配至300g，升/降速均为 5，再次离心 5min。取 1×106细胞检测 slanD胞表面 Gal-9 及 Tim-3 的表达，取 4×106细胞用于破膜及破核检pDC胞内Gal-9的表达。取0.5×106细胞用于检测外源性Gal-9对slCD40、CD80 及 CD83 表达的影响。取 0.5×106细胞用于检测外源分泌细胞因子 IL-12 的影响。2.3.3 slanDC、mDC、pDC 的圈门策略

中国医科大学硕士学位论文HLA-DR+的细胞为 slanDC（p2）分别定义 CD11c+HLA-DR+、CD123+mDC（P3）、pDC（P4）。2.3.4 slanDC、mDC、pDC 表面 Gal-9、Tim-3 的表达标记好流式管，取 1×106/管 PBMC 对 slanDC、mDC、pDC 表达的做表面染色：HLA-DR-APC-Cy7、M-DC-8-FITC、CD11c-BV421、CGal-9-PE、Tim-3-PE-Cy7，均为 5ul/管。混匀后，4℃避光染色 30mi入 2mlPBS，室温，300g，升 5/降 5，离心 5min，离心后弃上清，重悬细胞及 200ulEDTA 后应用 LSRⅡ流式细胞仪进行检测，FlowJo 进行分析略如图 2 所示：

7图 3 slanDC、mDC、pDC 胞内 Gal-9 的测定 为淋巴细胞及单核细胞与单核细胞及淋巴细胞之间的细胞，以 p1 为门，定义 MR+的细胞为 slanDC（p2），定义 CD11c+HLA-DR+、CD123+HLA-DR+细胞为pDC（P4）。再以 p2、p3、p4 为门分析 slanDC、mDC、pDC 胞内、核内 Gal-9 的重组 Gal-9 对 slanDCCD40、CD80、CD83 及 Tim-3 表达的影响记好流式管，取 0.5×106/管 PBMC，分别是空白对照组、阳性对照组、-9 组。每管加入 R10 培养基 500ul，加入 LPS 500ug/ml、Gal-9 10ug/ml，破膜对照 破膜 破核对照破核

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