乙型肝炎病毒rtA181T突变引起的S蛋白截短与非截短型突变的临床与表型特点分析

发布时间：2020-07-29 21:33

【摘要】：目的:临床上经核苷(酸)类似物(NAs)治疗的慢性乙型病毒(hepatitis B virus,HBV)感染患者可发生HBV RT区耐药相关突变,其中rtA181T突变可同时引起与RT基因重叠的S基因突变。本研究旨在明确HBV rtA181T突变引起截短型S蛋白的sW172*截短型突变与非截短型S蛋白的sW172L/S非截短型突变的临床发生特点及其与NAs耐药的相关性。方法:纳入2007年-2016年就诊解放军第三0二医院临床研究管理中心的22 009例接受NAs治疗的CHB患者,整理患者临床资料和抗病毒用药信息,收集血清样本,应用巢式PCR法直接检测HBV RT/S区序列耐药突变;分析rtA181T突变的临床发生特点,包括rtA181T引起的s W172*与sW172non-stop突变的临床发生特征;此外,对4例接受过NAs长期治疗并先后出现rtA181T/sW172*与rtA181T/sW172non-stop突变的rtA181T阳性患者样本进行了动态分析,收集患者血清并提取病毒DNA,通过克隆和测序分析RT/S区耐药突变;筛选出伴有rt A181T/sW172non-stop突变的患者,收集血清样本,巢式PCR法检测其HLA-A2亚型;选取来源于同一患者的克隆株、构建1.1倍HBV重组质粒,对rtA181T/sW172突变相关的10种不同的突变株及野生株进行体外表型耐药实验。将野生病毒株与突变株重组质粒转染到HepG2细胞内,测定并观察HBV DNA、HBsAg水平和突变株药物敏感性。结果:检出rtA181T阳性突变1182例,发生比例为5.37%,其中发生rtA181T突变后反应在重叠S区172位点的变化为截短型(Stop)和非截短型(包含L与S两种形式)两种,其中rtA181T/sW172non-stop(sW172L/S),rtA181T/sW172*/non-stop和rtA181T/s W172*的发生率为7.70%,9.39%和82.91%。rtA181T/sW172non-stop突变患者HBV DNA高于rtA181T/sW172*突变患者,有显著统计学差异。在1182例发生rtA181T突变患者中,rtA181T/sW172non-stop突变的发生率呈现递增的趋势(P0.05):2007-2010年的4.43%(27/610),2011-2013年10.09%(34/337)、2014-2016年的12.77%(30/235)。在联合耐药突变形式上,有44.33%(524/1182)的rtA181T阳性突变患者联合其他NAs耐药突变出现,其中325例伴有ADV相关耐药突变(rtA181V/N236T),57例伴有LAM相关耐药突变(rtM204V/I),99例伴有ETV耐药突变(rtM204V/I±rt184/202/250),43例伴有MDR突变(rtA181V/N236T+rtM204V/I±rt184/202/250)。其中rtA181T/sW172non-stop突变患者中伴随阿德福韦突变出现频率高于rtA181T/sW172*突变患者(42.86%/24.59%,P0.001)。rtA181T/sW172non-stop突变患者中HLA-A2阳性检出率为43.07%。表型实验中,rtA181T/sW172S+N236T、rtA181T/sW172L+N236T相对于野生株复制力高于rtA181T/sW172*+N236T的(98.02%、85.45%、42.09%),其相对于野生株的对阿德福韦的耐药倍数分别是7.38倍、5.49倍、3.69倍。rtA181T/sW172L+S202G+M204V相对于野生株复制力高于rtA181T/sW172*+S202G+M204V的(50.98%、34.49%),其相对于野生株的对恩替卡韦的耐药倍数是524.00倍、69.33倍。结论:临床上,近些年在rt A181T阳性突变患者中rtA181T/sW172non-stop突变的发生呈现上升趋势,rtA181T/sW172non-stop突变能够增加病毒复制水平,尤其是联合阿德福韦酯或恩替卡韦突变株出现时显著降低病毒株对阿德福韦酯或恩替卡韦的敏感性。
【学位授予单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R512.62
【图文】：

结构示意图,菌液

图 1 PTriEx-1.1-HBV（C）结构示意图[21]Figure 1 Schematic diagram ofpTriEx-1.1-HBV（C）.2 突变株重组质粒构建及鉴定提取实验用的目的质粒（按照上海生工公司质粒提取试剂说明书进1）在 3mL 的液体 LB 培养基中加入 50μL 菌液（pTriEx-1.1-HBV（体和克隆成功的 T-easy 载体菌液），37℃ 220rpm 过夜。2）将处理好的菌液转移至 1.5mLEP 管，10000rpm 离心 1 分钟，移上清。3）向 EP 管中加入 250μL 的 Buffer P1，经涡旋振荡器处理，使沉混匀，重悬细菌。4）向 1.5mL EP 管中加入 250μL 的 Buffer P2，然后马上温和颠倒

发生率,患者,位点突变

图 3 患者中 rtA181T/sW172non-stop 突变的发生率及 ADV 用药的构成比Figure 3 The prevalence of rtA181T/sW172non-stop mutation and the proportion of ADV exposure in thpatients (*<0.05)4）我们分析 1182 例 rtA181T 突变患者的 sW172 位点突变及伴随出现的其他耐药突变结果显示， rtA181T/sW172non-stop(sW172L/S) rtA181T/sW172*/non-stop 和 rtA181T/sW172*的发生率为 7.70% ,9.39%和82.91%。直接测序中有将近一半的 rtA181T 突变联合 ADV 相关耐药突变出现，其中 rtA181T/sW172non-stop 中 ADV 相关耐药突变的发生率显著高于rtA181T/sW172*中的（表 2）

亚型鉴定

图 4 HLA-A2 亚型鉴定结果Figure 4 Identification results of HLA-A2 subtype181T 突变患者演变分析结果HBV RT/S 区 PCR 扩增及 TA 克隆结果电泳检测 RT 区的 PCR 扩增产物，目的产物大小位置在 12期预测结果相符。电泳结果见下图，M：DNA 分子量 2000 M上到下的分子量大小为 2000bp，1000bp，750bp，500bp，RT 1M 1 2 3 4

【参考文献】