NK细胞在干扰素治疗恩替卡韦经治慢性乙型肝炎患者中促进乙肝表面抗原清除的作用及机制研究

发布时间：2020-08-02 17:00

【摘要】：【研究背景】目前乙型肝炎病毒(HBV)在全球大约有4亿慢性感染者,是世界性的健康问题之一。我国是乙型肝炎病毒感染的高发地区,防治尤为迫切。对于慢性乙型肝炎患者,清除其乙肝表面抗原是目前乙肝治疗的理想目标。目前治疗慢乙肝常用的抗病毒药物包括干扰素类(IFN)及核苷(酸)类似物(NA),其中干扰素能够通过直接抗病毒作用及调节机体免疫,实现对乙肝表面抗原(HBsAg)的清除以及血清学转换。本研究也发现,使用干扰素治疗的恩替卡韦经治患者在治疗结束时的乙肝表面抗原显著下降,实现乙肝表面抗原消失和达到血清学转换的比率较高,而NK细胞是机体抗病毒免疫中的重要效应细胞之一,在慢性乙肝病毒感染过程中NK细胞的数量减少及功能低下,而抗病毒治疗最终需要达到免疫恢复的状态,NK细胞的数量和功能的恢复对于提高抗病毒治疗的疗效具有重要意义,目前NK细胞作用于乙肝表面抗原的免疫学过程及其机制尚未得到阐明。【研究目的】研究NK细胞在干扰素治疗恩替卡韦经治的慢乙肝患者的过程中,清除乙肝表面抗原的作用及其机制,为慢乙肝治疗新策略的制定提供理论依据。【研究方法】1、建立病例对照研究队列。共入组55名慢性乙型肝炎患者(具体的入组标准和排除标准见“材料与方法”部分),按照1:1的比例将入组患者随机分为A、B两组,其中A组使用peginterferon alfa-2a(PEG-IFNα-2a,派罗欣,Roche)180μg/周治疗,为防止停用恩替卡韦可能导致的病毒量反弹,先联合恩替卡韦治疗8周后,再单用PEG-IFNα-2a治疗。B组则继续恩替卡韦(ETV,博路定,Bristol-Myers Squibb)0.5 mg/天,治疗时间共为48周。分别在基线期、4周、12周、24周和48周留取患者的外周血,同时检测HBVDNA、HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb和ALT。病毒学应答(viral responder)的定义:将在治疗48周时出现任何乙肝表面抗原下降的患者定义为“responder”。2、利用流式细胞术,在检测患者临床指标的同时,检测两组患者的外周NK细胞、CD56~(bright)、CD56~(dim)亚群的比例和数量,同时检测NK细胞表面活化性受体NKp30、NKp46、NKG2C和NKG2D受体、抑制性受体NKG2A及TRAIL的表达水平。3、通过胞内细胞因子(ICK)染色技术检测治疗24周患者NK细胞分泌IFN-γ和TNF-α的水平。4、通过磁珠分选技术(MACS)分离患者的外周NK细胞,与HepAD38细胞共培养,或在培养体系中分别或联合加入TRAIL、IFN-r及TNF-a中和抗体,于培养后1天、2天和3天检测培养上清液中HBsAg的水平,通过Realtime-PCR技术检测相应的cccDNA(covalently closed circularDNA)水平。5、通过蛋白质免疫印迹(Western Blot)技术检测,加入TRAIL、IFN-r及TNF-a中和抗体后APOBEC3A及APOBEC3B蛋白的变化。【研究结果】1、与恩替卡韦组相比,干扰素组患者在治疗结束时的乙肝表面抗原显著下降,实现乙肝表面抗原消失和达到血清学转换的比例较高(P值均小于0.05)。2、两组总体NK细胞的数量和比例无明显变化。亚群分析显示,与恩替卡韦组相比,干扰素组患者在治疗24周和48周时HBsAg显著下降(P值均小于0.05),在治疗24周和48周时干扰素组患者的CD56~(bright)NK细胞显著增加,而CD56~(dim)NK细胞则显著减少(P值均小于0.05),干扰素组的“responder”与“non-responder”相比,CD56~brightright NK细胞在12周及24周显著增加,CD56~(dim)NK细胞则显著减少(P值均小于0.05)。3、与恩替卡韦组相比,干扰素组患者的NK细胞活化型受体NKp30和NKp46的表达无明显变化,而CD56~(bright)NK细胞的NKp30和NKp46的表达则自治疗4周起至48周均显著升高(P值均小于0.05),且与干扰素无应答者相比,干扰素应答者NKp30和NKp46的表达在24周时显著增加(P值均小于0.05)。而在CD56~(dim)NK细胞亚群NKp30和NKp46的表达无显著变化,活化性受体NKG2D、NKG2C、抑制性受体NKG2A的表达,在恩替卡韦和干扰素两组间均无显著差异(P值均大于0.05)。4、与恩替卡韦组相比,干扰素组患者在治疗24周时,NK细胞、CD56~(bright)NK细胞及CD56~(dim)NK细胞表达的TRAIL显著增高,其分泌TNF-a和IFN-r显著的增加,且CD56~(bright)NK细胞表达的TRAIL增加更为显著(P值均小于0.05)。5、干扰素治疗24周时,患者NK细胞的比例与乙肝表面抗原的下降无显著相关性(P=0.765,R=0.061),CD56~(bright)NK细胞的比例与乙肝表面抗原下降显著正相关(P=0.0028,R=0.630),NKp30+CD56~(bright)NK细胞的比例及NKp46+CD56~(bright)NK细胞的比例与乙肝表面抗原的下降无显著相关性(P值均大于0.05)。6、治疗24周时,通过磁性细胞分选技术(MACS)分选获得干扰素组和恩替卡韦组患者的NK细胞,并与HepG2.2.15 cell共培养,结果显示共培养1天、2天和3天后干扰素组培养上清中乙肝表面抗原的下降幅度均高于恩替卡韦组(P值均小于0.05)。进一步在培养体系中单独或联合加入TRAIL、IFN-r及TNF-a中和抗体,结果显示,与未加中和抗体的对照孔相比,单独加入TRAIL中和抗体或TRAIL联合IFN-r或TNF-a中和抗体的培养上清乙肝表面抗原的水平均显著增高,cccDNA显著增加,而APOBEC3A及APOBEC3B蛋白水平下降(P值均大于0.05)。【研究结论】1、在恩替卡韦经治的慢乙肝患者使用干扰素治疗24周后,CD56~(bright)NK细胞的数量和比例逐渐增加,相对应乙肝表面抗原则逐渐下降,且在24周时,乙肝表面抗原的下降和CD56~(bright)NK细胞的增加显著相关,提示CD56~(bright)NK细胞在乙肝表面抗原清除的过程中可能起到了重要的作用。2、干扰素应答者,其CD56~(bright)NK细胞的活化受体NKp30、NKp46在使用干扰素治疗24周升高,提示干扰素治疗过程中早期受损的免疫系统功能可能逐渐恢复和重建,而CD56~(bright)NK细胞功能的恢复可能是免疫重建期的重要构成之一。3、在干扰素治疗24周后,随着免疫重建的逐渐加强,机体可能逐渐进入了以乙肝表面下降为特点的免疫效应期,其中恢复功能的CD56~(bright)NK细胞可能通过TRAIL/TRAIL-R的溶细胞途径和IFN-r及TNF-a上调APOBEC3A和APOBEC3B蛋白,间接非溶细胞途径清除乙肝表面抗原。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R512.62
【图文】：

NK细胞,外周血,患者

分别在治疗的 4 周、12 周、24 周和 48 周时检测患者外周血的比例，如图 2-4 所示“responder”与“non-responder”的 NK 细图 2-4

所示，与“non-responder”相比，A组的“responder”的NKp30+NK细胞和NKp46+NK细胞无显著变化

30如图3-4所示，A组的“responder”的NKp30+ CD56brightCD56brightNK 细胞在4周、12周、24周和48周显著增加(P值

【参考文献】