HEV与血小板相互作用的初步研究

发布时间：2020-09-02 14:22

　　 研究目的:初步探究戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是否可以感染血小板,并促进血小板的活化及外泌体的分泌。血小板分泌的外泌体是否能够促进HEV的传播。研究方法:本研究通过建立HEV扩增培养体系和HEV RNA qRT-PCR检测方法,收集HEV病毒液并检测HEV核酸浓度。将健康人洗涤血小板与HEV共培养,运用qRT-PCR检测血小板中HEV RNA载量并绘制生长曲线,间接免疫荧光法检测血小板中HEV ORF2蛋白;流式细胞术检测血小板表面CD41a和CD62p分子的表达;运用差速离心法和免疫磁珠法分离并纯化HEV或PBS作用后的血小板分泌的外泌体,qRT-PCR和ELISA分别检测两组外泌体中HEV RNA和HEV抗原;将两组外泌体感染PLC/PRF/5细胞,qRT-PCR和间接免疫荧光法分别检测PLC/PRF/5 细胞中 HEV RNA 和 HEV ORF2 蛋白。研究结果:结果发现当HEV浓度为4×109copies/mL,共孵育时间为24h时,血小板结合或内化的病毒量最高为(2.34±0.39)×107 copies/mL;血小板在培养过程中,血小板结合或内化的病毒总量,第1天低于第0天,差异有统计学意义(P0.001)。在第1天至第5天,病毒载量基本稳定在107copies/mL;随着时间的增加,CD41a和CD62p双阳性细胞比例增加约10-20%。在每个时间点,实验组比对照组平均增加约4%(P0.01);与HEV孵育后的血小板分泌的外泌体中含有HEV核酸及蛋白组分,将阳性外泌体感染PLC/PRF/5细胞后发现PLC/PRF/5细胞中HEV核酸及蛋白呈阳性反应。研究结论:HEV可以进入血小板,但HEV进入血小板的机制及是否在血小板内复制还需进一步研究;HEV可以促进血小板的活化及外泌体的分泌;经HEV作用的血小板分泌的外泌体可以介导HEV在PLC/PRF/5细胞中的传播。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R512.6
【部分图文】：

中国医学科学院北京协和医学院硕士学位论文四、实验结果逡逑ＨＥＶ邋ＲＮＡ邋ｑＲＴ－ＰＣＲ检测方法的建立逡逑标准品的制备逡逑Ｒ目的片段的获取逡逑为日￡NB０３基因组的部分片段，全长２６５卜口，１１丁１0１后１）：逡逑Ｍａｒｋｅｒ空白丨邋２逦３逡逑

Ｍａｒｋｅｒ空白丨邋２逦３逡逑２５０逦￣２６５邋ｂｐ逡逑■逡逑图１邋ＲＴ－ＰＣＲ琼脂糖凝胶电泳结果逡逑组质粒的鉴定逡逑用的是ｐＵＣｍ－Ｔ载体，大小为２７７３邋ｂｐ，目的片段大小为２粒，测序，与目的序列进行序列比对。确定重组质粒正确。逡逑粒的酶切与体外转录逡逑Ｓａｃｌ限制性内切酶酶切，后检测到约为２８００邋ｂｐ的条带。结Ｍａｒｋｅｒ质粒逡逑

１．２邋ｑＲＴ－ＰＣＲ反应体系及标准曲线的建立逡逑１．２．１扩增曲线图逡逑将梯度稀释的标准品进行实时荧光定量ＰＣＲ反应，得到扩增曲线，见图３。逡逑图中各曲线拷贝数从左向右分别为１０１Ｇ、丨０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４、１０３逡逑ｃｏｐｉｅｓ／ｕｌ0逡逑Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋Ｐｌｏｔ逡逑１００００００逡逑１０００００逦逦逦逦逡逑产邋１００００邋２，＾７６．６８３３３６逡逑｜邋１000逡逑１逦：逦—＊逦：—：逦逦逦：—逡逑２逦４逦６逦８逦１０邋１２邋Ｕ邋１６逦１８邋２０逦２２邋２！逦２６邋２６邋３０逦３２逦３６邋３６逦４０逡逑Ｃｙｃｌｅ逡逑图３重组质粒ＲＮＡ标准品扩增曲线逡逑１．２．２标准曲线图逡逑根据标准品理论拷贝数和Ｃｔ值，得到了以拷贝数（ｃｏｐｉｅｓ／此）为横坐标，循逡逑环数（Ｃｔ）为纵坐标的标准曲线（图４）。据ＡＢＩ邋７５００邋ｓｏｆｔｗａｒｅ邋ｖ２．３，得到标准曲逡逑线斜率为－３．５０８，截距为４８．４７２，相关系数为０．９９９，回归公式为：ｙ＝－逡逑３．５０８ｒ＋４８．４７２0逡逑Ｓｔａｎｄａｒｄ邋Ｃｕｒｖｅ逡逑３５逡逑３０逡逑0邋２５逡逑ｊ逡逑１５逦邋５逡逑１００邋２０Ｄ邋削逦１＜Ｕ３０逦１００００３邋ＫＯＣＤＸｌ邋ＩＯＵＸＩｌＩＯ邋ＩＱＸｌＸＯＸｌ邋１ＣＤ３０ＤＸＣＩ邋ｔＯＯＸＯＣｍＣＯ邋ｌＯＯＣＯＸｌＯ逡逑Ｑｕａｎｔｉｔｙ逡逑图４重组质粒ＲＮＡ标准品标准曲线逡逑１．２．３重复性评价逡逑通过标准曲线计算相应拷贝数，计算拷贝数的平均值、方差和变异系数。统逡逑计结果显示

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本文编号：2810711