结核分枝杆菌耐PAS基因型与表型相关性的研究

发布时间：2020-09-02 18:35

　　 目的:了解结核分枝杆菌临床分离株耐对氨基水杨酸(PAS)相关基因的突变频率以及与结核分枝杆菌药敏表型的相关性,为耐PAS相关基因分子检测提供实验室数据,并为耐药结核病的治疗提供参考。方法:收集2015年3月至2018年3月肺结核患者临床标本进行抗酸染色、结核分枝杆菌培养及药物敏感试验,获得226例有药敏结果的结核分枝杆菌临床分离株,其中敏感120例和耐药106例。利用CTAB法提取上述菌株的DNA,分别对耐PAS相关基因thyA、folC和ribD进行PCR和基因测序,并与结核分枝杆菌标准株H37Rv序列进行分析比对,获取PAS耐药相关基因的突变位点,并与PAS药敏表型比较。结果:本研究分别对耐PAS相关基因thyA、folC和ribD进行PCR扩增和测序分析。226例临床分离株,thyA基因分析215例临床分离株,其中敏感株111例,耐药株104例,PAS表型敏感株212例,PAS表型耐药株3例。215例中4例发生thyA基因突变,总突变率1.9%(4/215),其中3例为耐药株,突变率2.9%(3/104),突变形式ACC22GCC(Thr22Ala)、CAC75AAC(His75Asn)和CAA97CGA(Gln97Arg),ACC22GCC为新突变,已上报GenBank,基因库号:MK674466;1例为敏感株,突变率0.9%(1/111),突变形式TAC164AAC(Tyr164Asn)。在PAS表型敏感株中突变率1.4%(3/212),在PAS表型耐药株中的突变率33.3%(1/3)。226例临床分离株,folC基因分析216例临床分离株,其中敏感株118例,耐药株98例,PAS表型敏感株212例,PAS表型耐药株4例。216例中2例发生folC基因突变,总突变率0.9%(2/216),均为耐药株,突变率2.0%(2/98),突变形式GGT206AGT(Gly206Ser)和GCC325GTC(Ala325Val),GGT206AGT为新突变,已上报GenBank,基因库号:MK674459;在PAS表型敏感株中突变率0.9%(2/212),在PAS表型耐药株中未检测到folC基因突变。226例临床分离株,ribD基因分析206例临床分离株,其中敏感111例,耐药95例,PAS表型敏感株203例,PAS表型耐药株3例,仅1例发生ribD基因突变,总突变率0.5%(1/206),为耐药株,突变率1.1%(1/95),突变形式ACC245GCC(Thr245Ala)。在PAS表型敏感株中突变率0.9%(1/203),在PAS表型耐药株中未检测到ribD基因突变。结论:本研究所检测到的thyA基因ACC22GCC(Thr22Ala)、CAC75AAC(His75Asn)和CAA97CGA(Gln97Arg)突变,folC基因GGT206AGT(Gly206Ser)和GCC325GTC(Ala325Val)突变及ribD基因的ACC245GCC(Thr245Ala)突变与耐异烟肼及耐多药密切相关,提示这些基因的突变可能与异烟肼存在交叉耐药;thyA基因ACC22GCC突变与PAS耐药相关,其余的突变与PAS表型耐药无明显关系。该研究发现thyA基因ACC22GCC(Thr22Ala)和folC基因GGT206AGT(Gly206Ser)的2个新突变位点。
【学位单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R52
【部分图文】：

图 1 ND-1000 检测结核分枝杆菌 DNA 浓度 扩增结核分枝杆菌 thyA 基因全长和测序分析增 thyA 基因并验证.tb 临床分离株中，thyA 基因全长全部扩增，并经凝胶电泳成92 bp 位置出现目的条带（图 2 ）。

31图 2 结核分枝杆菌临床分离株 thyA 基因全长 PCR 产物凝胶图注：2%琼脂糖凝胶 M：1000 bp Marker 阴：阴性对照 H2O1～13：结核分枝杆菌临床分离株hyA 基因突变图谱及序列分析thyA 基因测序结果在 NCBI 中和 H37Rv 标准序列进行比对分析，得序图谱及突变后的全基因序列如下。

图 3 thyA 基因 64 位点突变测序图谱基因序列标注上下游引物及 A64G 位点如下，下划线加粗为上下粗为突变后的碱基。ATACGAGGACCTGCTGCGCTTCGTGCTCGAAACGGGTACCGCGCCGGCACCGGAACCCGCAGCCTGTTCGGCCAGCAGTCGGCCGGTTTCCCGCTGCTCACTACCAAGAAAGTCCATTTACGAGCTGCTGTGGTTTTTGCGCGGCGATTCCAATATCGGACGGAGTCACCATCTGGGACGAATGGGCAAGTGATACAGATCTACGGTGTACAATGGCGATCGTGGCCGGCTCCATCCGGCAGATCAGCGCGGCGCTGGATTTGCTGCGCACCGATCCCGATCGTGTCGGCCTGGAACGTCGGCGAAATCGAGCGGATGGTCATGCGTTCTTCCAGTTCTACGTCGCCGATGGCCGGCTGACCAACGCAGCGCCGACCTGTTTCTGGGTGTGCCGTTCAAC

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本文编号：2810951