隐匿性乙型肝炎病毒（HBV）感染患者HBVS基因突变特点及突变病毒株致瘤性研究

发布时间：2020-09-03 11:57

　　目的:研究肝病人群中隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV S基因主要亲水区(MHR)的突变特点及突变病毒株的致瘤性。方法:回顾性分析解放军总医院第五医学中心临床研究管理中心血清库中2011年9月-2016年3月的7 323例患者样本,分析OBI检出率及其HBV S基因MHR突变特点。并选取其中一例典型OBI患者来源的一株新型突变病毒株aa126-127“RPCMNCTI”insertion,用pLVX-Puro慢病毒表达载体感染HepG2细胞,通过嘌呤霉素筛选出突变型的稳定细胞株,同样方法筛出野生及空载体对照组稳定细胞株;Western Blot实验分析目的蛋白表达;通过克隆形成实验和CCK-8实验分析突变组与野生和空白对照组细胞在克隆形成能力和增殖能力上的差异;采用划痕实验和Transwell侵袭实验分析突变组与野生和空白对照组细胞在迁移能力和侵袭能力上的差异;通过细胞周期实验和ROS检测实验分析突变组细胞周期的情况和细胞内ROS的水平。结果:样本库中7 323例患者同时检测了血清HBsAg和HBV DNA,筛查出血清HBsAg阴性及HBV DNA阳性的OBI患者14例,OBI检出率为0.191%(14/7323)。14例患者中检出9种MHR突变类型,除126-127“RPCMNCTI”insertion和F161S变异外其余变异均为已报道的OBI相关突变。Western Blot检测到突变蛋白表达,鉴定稳定细胞株构建成功;细胞肿瘤表型实验结果显示,与空载体对照组和野生组细胞相比,突变组细胞的增殖、克隆形成和迁移侵袭能力均明显增加,且突变组细胞内ROS水平明显升高。结论:本研究显示肝病人群中有较高的OBI检出率,且多数患者可检出文献报道的OBI相关突变。“aa126-127‘RPCMNCTI’insertion”新型突变HBV S基因具有促进肿瘤生长的细胞生物学特点,可能会增加慢性HBV感染患者向肝癌进展的潜在风险。
【学位单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R512.62
【部分图文】：

样本,琼脂糖电泳,巢式PCR,基因

图 1 巢式 PCR 扩增样本的 HBV S 基因琼脂糖电泳结果Figure.1 Electrophoretic analysis of HBV S gene by nested-PCR ampliM 为电泳分子量标准；1-14 为患者样本编号；+为阳性对照；--为阴

片段,目的,突变型,PCR扩增

28图 2 目的片段 PCR 扩增结果Figure 2 The aim gene fragment of PCR amplification标准；NG 为 126-127“RPCMNCTI”insertion 突变型；Wt 为 wild

标签,突变型,野生型,氨基酸序列

2.2.2 pLVX-Puro-S-his 重组质粒测序结果经 DNA 测序后比对，分别成功构建野生型 pLVX-Puro-S-his-Wt 和突变型pLVX-Puro-S-his-NG的重组质粒，其MHR区氨基酸序列比对结果见图3。pLVX-puro 慢病毒质粒中插入了 HBV S 基因区和标签蛋白，使 HBsAg 的 C端加了一个 myc 标签（EQKLISEEDL）和一个 6 个组氨酸 H 组成的 His 标签，用于表达 HBsAg-His 标签融合蛋白，因 His 标签不影响 HBsAg 抗原性，其本身也不涉及抗原性，故将 His 标签作为重组蛋白表达内参。图 3 野生型及突变型重组质粒 MHR 氨基酸序列比对及 S 区末端融合 myc 和 His 标签Figure 3 Wild-type and mutant recombinant plasmid MHR amino acid sequence alignmentand s-region fusion myc and His tagsS 区标准序列为来自 GenBank 上 HBV 野生序列；pLVX-Puro-S-NG 为 aa126-127 “RPCMNCTI”insertion 突变型质粒序列；pLVX-Puro-S-Wt 为实验对照野生型质粒序列；“RPCMNCTI”为突变型基因中间插入序列；“EQKLISEEDL”为 S 基因 C 端 myc 标签序列；“HHHHHH”为 S 基因 C 端 His 标签序列2.3 稳定细胞株重组 HBV S 蛋白的 Western Blotting 分析Western blotting 结果显示，野生株产生的 HBsAg-His 标签融合蛋白由 2个条带组成，即 1 条 27kD 非糖基化条带（HBsAg 分子量 24kD

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