AML1-ETO9a的产生机制及恶性血液病侵袭性真菌病的二级预防

发布时间：2020-09-19 11:28

　　目的：染色体易位是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)最常见的细胞遗传学异常。t(8;21)(q22;q22)是AML中最常见的染色体易位,易位形成的AML1-ETO融合基因是t(8；21)AML的显著特征和始发因素,同时,存在其他的事件协同引起AML的发生。研究证实,AML1-ETO的选择性剪切体AML1-ETO9a与此类白血病的发生、发展及预后密切相关,但AML1-ETO9a产生的调控机制目前尚不清楚。材料与方法：1、收集21例AML1-ETO阳性配对样本(同一患者不同病程的样本,包含初治或者复发的样本以及缓解的样本),2例AML1-ETO阴性(也属于AML-M2患者)配对样本,进行外显子高通量测序分析体细胞突变数；对23例样本的突变基因重现性分析；2、从大量AML临床样本和正常人骨髓表达芯片数据库中,分析不同染色体核型样本中,富含丝氨酸／精氨酸剪接因子(serine/arginine-rich splicing factor, SRSF)总体上的表达水平;分析22例AML1-ETO阳性、22例AML1-ETO阴性和5例正常人骨髓中表达芯片数据库,找出在AML1-ETO阳性样本中异常高表达的剪切因子SRSF2、SRSF6和SRSF11;克隆ETO9a外显子及其侧翼序列,体外转录,RNA沉淀(RIP),质谱分析,对所得到的145个差异且有意义的蛋白进行信号途径分析;Western blot对RIP及质谱结果进行验证;3、构建SRSF2的慢病毒表达载体,转染细胞株,克隆形成实验及细胞增殖实验,证实SRSF2对选择性剪切体AML1-ET09a产生的影响,以及对AML1-ETO阳性和阴性的细胞增殖及恶性表型的影响;4、生物信息学分析及荧光素酶验证AML1-ET09a是miR-9-1的靶基因；荧光定量PCR检测miR-9-1在细胞系和临床样本中的表达。结果：1、外显子高通量测序结果表明：23例样本,每个初治或者复发样本的体细胞平均突变位点数目为18.6个,突变基因重现性统计,分析可能存在的共性基因突变,其中重现性最高的基因是c-KIT,其重现性为17.4%(4/23),其次为NRAS占13%(3/23), FLT3、NOTCH1、PHF6各占8.7%(2/23)。总结苏州大学和我们的临床样本分析数据以及美国UCSD张东尔教授的结果发现,AML1-ETO9a在AML1-ETO阳性的临床样本中所占得比例分别为100%(44/44)、100%(10/10)和95%(35/37),均远高于c-KIT突变。2、在t(8;21)AML中,SRSF总体上的表达明显比其它各型染色体异常AML临床样本中高,进一步研究发现,SRSF2、SRSF6、SRSF11这三个剪切因子在AML1-ETO阳性的AML中异常高表达。3、用ETO9a外显子及其侧翼序列进行的RIP及质谱分析,对有差异的145个有意义的蛋白进行信号途径分析发现,超过82%(119/145)的蛋白与核mRNA的剪切、加工、剪切复合体的装配、调控密切相关,其它的18%(26/145)蛋白则负责调控细胞的凋亡和死亡。SRSF2的慢病毒转染AML1-ETO阳性的细胞株Kasumi-1和SKNO-1,定量PCR检测AML1-ETO和AML1-ETO9a的表达,发现在这两种细胞系中AML1-ETO9a的表达量显著提高,分别从13%和7.5%提高到54.2%和50.6%,证实SRSF2可以导致AML1-ETO9a选择性剪切体的产生,克隆形成实验及细胞增殖实验证实,SRSF2可特异性地调控AML1-ETO融合基因阳性细胞的恶性增殖,而对AML1-ETO阴性的细胞系如HL-60则没有影响。4、生物信息学分析、荧光素酶报道载体及Western blot证实,AML1、AML1-ETO、AML1-ET09a都是miR-9-1的靶基因,而实时荧光定量PCR证实miR-9-1在t(8;21)AML表达明显降低。结论：1、从遗传学、基因结构、基因功能及重现性上来说,AML1-ET09a是t(8;21)AML一个更为普遍的“第二次打击”；2、在转录／剪切水平上,剪切因子SRSF2促进了AML1-ET09a的选择性剪切,并且特异性地促进了AML1-ETO阳性细胞的恶性增殖;3、翻译水平上,AML1-ET09a是miR-9-1的一个靶基因,miR-9-1可以抑制AML1-ET09a的蛋白翻译,而miR-9-1在t(8;21)AML中表达明显降低,从而导致AML1-ET09a大量翻译出蛋白,导致t(8;21)AML的发生。目的：侵袭性真菌病(invasive fungal disease, IFD)在恶性血液病患者中发病率和死亡率均很高,有IFD病史的患者在进一步的化疗或造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)中,IFD复燃率高,预后差。二级预防(secondary antifungal prophylaxis, SAP)可有效地预防IFD复燃。本研究旨在探讨有IFD病史的恶性血液病患者接受进一步的化疗或HSCT时进行SAP的策略和疗效,分析SAP失败的危险因素。材料与方法：我们回顾性分析了2008年1月至2013年6月就诊于我院血液科接受化疗或HSCT且既往有IFD病史的恶性血液病患者的病历资料,分析患者的临床特点和IFD的诊断标准,探讨不同SAP策略的疗效以及影响IFD复燃的危险因素。结果：入组164例患者,中位随访180天,40例出现IFD复燃,其中121例(73.78%,121/164)进行SAP的患者复燃20例,复燃率为16.5%(20/121),43例未进行SAP的患者复燃20例,复燃率为46.5%(20/43),两组复燃率比较有显著性差异(p=0.000)。121例进行SAP的患者,其中58例选用既往抗真菌治疗有效的药物进行SAP,8例IFD复燃,复燃率13.8%(8/58),63例换用其他广谱抗真菌药物进行SAP,12例IFD复燃,复燃率19.0%(12/63),两组复燃率比较无显著性差异(P=0.437)。异基因HSCT患者IFD复燃率(25%,15/60)明显高于化疗或自体HSCT患者(8.2%,5/61)(P=0.013)。多因素分析二级预防下IFD复燃的危险因素显示异基因HSCT为影响IFD复燃的独立危险因素。结论：对既往有IFD病史的恶性血液病患者予SAP可有效地防止IFD复燃,异基因HSCT患者的SAP更应重视。
【学位单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R733.7;R519

【参考文献】