弓形虫重组蛋白SAG1纳米金生物传感器诊断弓形虫病的研究

发布时间：2020-11-17 16:52

　　 目的:克隆和表达弓形虫截短型主要表面抗原1(tSAG1),建立诊断弓形虫病的纳米金生物传感器。方法:以弓形虫基因组DNA为模板,PCR扩增SAG1编码区515位至1267位的核酸序列,克隆至pMD18-T载体,测序鉴定,亚克隆至表达载体pET-28a(+),诱导表达tSAG1,金属螯合层析纯化,Western blot分析其免疫活性。种子生长法制备金纳米棒(Au NRs),偶联tSAG1,构建tSAG1-Au NRs生物传感器检测人血清抗弓形虫SAG1抗体;采用非参数检验分析测定值,按大于或等于体检健康者血清红移值的x+2SD判定为阳性,计算敏感度、特异度、预测值和诊断效率。谷胱甘肽法制备金纳米簇,经活化后,与羊抗人IgG连接;将tSAG1包被在微孔板孔内,与人血清弓形虫抗体结合,再与金纳米簇-羊抗人IgG作用,加入柠檬酸三钠溶液及吗啉乙磺酸-水合物溶液稀释的过氧化氢反应30min,再加入氯金酸溶液反应1h,肉眼观察结果,并测定550nm处的吸光度值OD_(550);采用非参数检验分析测定值,按小于或等于体检健康者血清OD_(550)的x-2SD判定为阳性,计算敏感度、特异度、预测值和诊断效率。结果:构建了tSAG1的表达质粒,表达纯化获得有免疫反应性的tSAG1,分子质量为约30kDa。tSAG1-Au NRs生物传感器的检验敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和诊断效率依次为80.9%、90.0%、90.2%、80.6%和85.2%。基于金纳米簇模拟酶性质构建的可视化生物传感器的检测敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和诊断效率依次为80.0%、90.0%、88.9%、81.8%和85.0%。结论:基于重组tSAG1建立的纳米金生物传感器可用于检测弓形虫抗体。
【学位单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78;R531.8
【部分图文】：

弓形虫重组蛋白SAG1纳米金生物传感器诊断弓形虫病的研究3.结 果的基因 tSAG1 的克隆与鉴定CR 扩增 tSAG1 基因的电泳图谱如图 1。PCR 获得了约为 760bp 的 tSAG克隆的 pMD18-T-tSAG1 的阳性菌落的 PCR 获得了约为 760bp 的片段（如测序结果与 GenBank 报道的 SAG1 进行 BLAST 比对（如图 3），在 77由 T 突变为 C，为错义突变，编码的氨基酸由 Ser 突变为 Pro。经 DNAstn 分析，其抗原表位未发生改变。

12图 3-3 pMD18-T-tSAG1 测序结果与 RH 株 JX045421.1 的 SAG1 基因序列对比重组表达质粒 pET-28a(+)-tSAG1 的构建重组表达质粒的双酶切（BamH I 和 Sal I）和菌落 PCR 图谱如图 4。由酶切和 PCR 均获得约为 760bp 的片段，与 SAG1 理论长度一致。

图 3-4 重组 pET-tSAG1 的鉴定标准；1: pET-tSAG1 质粒；2: pET-tSAG达、纯化与鉴定 pET-tSAG1 的菌株经 IPTG 诱导前株未见 tSAG1 大量表达，诱导后于包涵体中。表达的 tSAG1 的大小见图 6。纯化获得 tSAG1 的大小清抗体特异识别，提示具有良好的
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本文编号：2887718