马流感病毒反向遗传系统的建立

发布时间：2017-10-12 19:43

  本文关键词：马流感病毒反向遗传系统的建立

  更多相关文章： 马流感病毒 JL89 反向遗传学 相向转录质粒 pEZ

【摘要】：马流感病毒(Equine Influenza Virus,EIV)是感染马属动物并引发马流感的一种重要的传染病病原。其基因组由8条分节段的负链RNA构成,编码至少10种蛋白。1989年在中国黑龙江省和吉林省马流感疫情中分离到的A/equine/Jilin/1/1989(H3N8)(简称JL89)显示出与其他EIV有显著的差别。其基因在系统发育学上,介于EIV和禽流感病毒之间,且显示与禽流感病毒有更近的亲缘关系,这提示此病毒可能来源于禽类,打破种间屏障传播给马。此外,此病毒在马群中引起较高的发病率和死亡率。因而研究其分子进化与致病机理对理解和防控马流感具有重要意义。反向遗传学作为研究病毒的有力工具,在揭示流感病毒的跨种传播机制,致病机理,毒力决定因素等方面发挥着重要作用。因此,建立针对JL89的反向遗传操作系统将为解释JL89的上述科学问题提供平台。首先,本研究构建了含有EF1-α和polI启动子的质粒pEZ。并利用质粒转染技术,将重组质粒pEZ-vEGFP和pEZ分别转染HEK293T细胞,一方面,pEZ-vEGFP组可以观察到绿色荧光,而pEZ组观察不到;另一方面,pEZ-vEGFP组中可以扩增出vEGFP编码区和其非编码区,而pEZ组没有扩增出来;从而在+RNA和-RNA两个方面验证pEZ的具有相向转录的功能。其次,为了获得JL89基因组全序列,分别对8个节段的编码区和非编码区克隆并测序。一方面,利用RT-PCR技术,以提取的病毒RNA为模板,扩增8个节段,并测序;另一方面,使用RNA连接和RT-PCR技术,扩增8个非编码区,并测序。这样便获取了JL89的全基因组序列。然后,利用分子克隆技术将JL89的8个全长的cDNA分别克隆到pEZ中形成重组质粒,并通过western blot分析pEZ-HA转染HEK 293T细胞中HA蛋白表达情况,结果显示HA表达良好。进一步研究,将8个重组质粒共转染HEK 293T细胞拯救病毒。通过测定上清中的病毒粒子的TCID50,显示其滴度达5.34±0.22个log10TCID50/mL;经鸡胚扩大培养后测定其HA效价达到8 log2/50μL;在MDCK细胞上的生长特性与亲本相似;序列亦与亲本100%一致。这些证据充分显示已经建立起JL89的反向遗传平台。而为了进一步提高了本系统的严谨性,通过定点突变技术在HA节段上作两个点突变使其拥有HindIIII和NdeI酶切位点。经RLFP分析显示拯救出的分子标记病毒的HA节段可以被HindIIII和NdeI分别或同时切成2或3条带,而亲本的不能。这样便区分了拯救的病毒和亲本。最后,为了评价本系统拯救病毒的能力,以CMV为启动子的pBD系统为参照,通过TCID50的测定表明pEZ系统拯救的病毒滴度比PBD系统(3.76±0.69个log10TCID50/mL)高,且差异显著。本研究自主构建了相向转录质粒pEZ,并用其建立了JL89的反向遗传操作系统,且具有较高的病毒拯救能力。本系统将为进一步研究JL89的跨种传播机制、致病机理和毒力决定因素等提供有力的工具。
【关键词】：马流感病毒 JL89 反向遗传学 相向转录质粒 pEZ
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 英文缩略表11-12
• 第一章 引言12-22
• 1.1 马流感病毒的概述12-16
• 1.1.1 马流感病毒的生物学12-13
• 1.1.2 马流感病毒的基因组、蛋白质及其功能13-15
• 1.1.3 流感病毒的生命周期15
• 1.1.4 A/equine/Jilin/1/1989(H3N8)15-16
• 1.2 流感病毒的反向遗传学的研究现状16-21
• 1.2.1 依赖辅助病毒的病毒拯救系统17-18
• 1.2.2 不依赖辅助病毒的病毒拯救系统18-21
• 1.3 研究的目的与意义21-22
• 第二章 马流感病毒反向遗传系统的建立22-38
• 2.1 材料22-23
• 2.1.1 载体、病毒株、菌株、细胞和鸡胚22
• 2.1.2 主要生化试剂22
• 2.1.3 常用缓冲液和培养基22
• 2.1.4 主要仪器22-23
• 2.2 方法23-38
• 2.2.1 细胞和鸡胚的培养23
• 2.2.2 病毒培养23
• 2.2.3 相向转录质粒pEZ的构建23-28
• 2.2.4 pEZ的功能验证28-33
• 2.2.5 病毒RNA的提取33
• 2.2.6 JL89基因组全序列的测定33-34
• 2.2.7 8 个重组质粒的构建34
• 2.2.8 HA蛋白的检测34-35
• 2.2.9 病毒的拯救35
• 2.2.10 病毒变异体的拯救及鉴定35-36
• 2.2.11 拯救病毒的滴度测定36
• 2.2.12 拯救病毒的生物学特性的研究36-37
• 2.2.13 拯救病毒的遗传学研究37-38
• 第三章 结果38-44
• 3.1 成功构建载体PEZ且其具有相向转录的功能38-39
• 3.2 获得JL89基因组全序列及序列分析39-40
• 3.3 成功构建8个重组质粒且PEZ-HA的蛋白表达良好40-41
• 3.4 成功拯救出EIV病毒41-42
• 3.5 PEZ系统拯救病毒的滴度较PBD系统高42-43
• 3.6 救获病毒和亲本毒生物学特性相似43
• 3.7 救获病毒和亲本毒遗传学特性一致43-44
• 第四章 讨论44-46
• 第五章 全文结论46-47
• 参考文献47-55
• 附录55-62
• 致谢62-63
• 作者简历63

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