己烯雌酚残留免疫学快速检测研究

发布时间：2018-01-30 22:53

本文关键词： 己烯雌酚单克隆抗体间接竞争ELISA试剂盒试纸条残留　出处：《四川农业大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：己烯雌酚(Diethylstilbestrol,DES)属于非甾体雌激素,具有促进动物生长和提高动物瘦肉率等作用,曾经被当作促生长剂普遍应用于畜禽生产中,因其对人类有很强的致畸、致癌等毒副作用,大多数国家和地区已明确规定禁止在畜牧养殖中使用DES。为了降低动物生产成本,不规范使用己烯雌酚的现象仍然存在。传统的理化检测技术虽然能够监测动物源性食品中的DES残留,但其存在用时长、、程序繁琐费用高等不足,因此急需建立一种迅速、简便、灵敏、准确、成本低的分析方法。本研究应用已制备的免疫原DES-BSA和己烯雌酚单克隆抗体(DES McAb)制备了间接竞争ELISA(ci-ELISA)试剂盒(DES-Kit)和免疫胶体金标记快速检测试纸条(DES-Strip),并用液相色谱法(HPLC)和气-质联用法(GC-MS)对DES-Kit和DES-Strip的性能进行验证。1.在分析DES分子结构和免疫原性的基础上,经过一系列化学反应在DES苯环的羟基(-OH)位点上引入活性基团羧基(-COOH),合成具有半抗原结构特征的己烯雌酚-单-羧基丙基-醚(DES-MCPE),利用活性酯法使DES-MCPE与牛血清白蛋白(BSA)发生偶联,合成免疫原DES-BSA, DES-MCPE与鸡卵清蛋白(OVA)偶联,制备包被抗原DES-OVA。利用紫外扫描(UV)和SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行初步鉴定,实验结果显示,DES-BSA紫外扫描图的最大吸收峰发生偏移,DES-BSA的泳动率小于BSA,判定DES-BSA偶联成功,并测得DES与BSA分子结合比为12.8：1。用免疫原DES-BSA免疫3只BALB/c小鼠,5次免疫后获得了抗DES多克隆抗体(DES pAb),用间接ELISA检测DES pAb的效价均大于1：1.0×104,用cz-ELISA检测DESpAb的半数抑制浓度(IC50),其中测定结果最好的2号小鼠的IC50为18.221 μg/L,与己烷雌酚(HEX)和双烯雌酚的(DIEN)交叉反应率(CR%)分别为8.09%、3.63%与其他竞争物没有交叉反应(CR)。获得了灵敏、特异、高效价的多克隆抗体。2.利用ELISA筛选细胞融合鼠,应用融合剂聚乙二醇(PEG4000)使SP2/0瘤细胞与免疫小鼠的脾细胞发生融合,生成的杂交瘤细胞进一步筛选、克隆和扩大培养后,采用体内诱生腹水法生产己烯雌酚单克隆抗体(DES McAb),选取4株敏感性和选择性均好的抗DES杂家瘤细胞：1B8 DES McAb、2 C4DES McAb、4 Al DES McAb、4 C7 DES McAb,其细胞上清效价分别为：1：2.56×102、1：4.0×102、1：1.2×102、1：8.0 × 102,腹水效价分别为：1：2.0×105、1：2.56×105、1：128×105、1：5.12×105,亲和常数(Ka)分别为：3.38×109、9.27×109、2.30×109、1.87×1010 L/moL,单抗亚型分别为：]gG2a/κ、IgGl/κ、IgG2a/κ、IgG2a/K。ci-ELISA测定亲和力最高的4C7株的IC50为0.49μg/L,与HEX和DIEN的CR%分别为7.66%、3.83%,与其他竞争物没有CR。3.以DES McAb为基础,优化了ci-ELISA最佳实验条件。DES-OVA的包被浓度为0.5μg/mL, DES McAb的工作浓度为1：6.4×104；酶标二抗(GaMIgG-HRP)的稀释浓度为1：1×103；最佳包被条件为37℃,包被原DES-OVA孵育120min,37℃,5%的猪血清封闭60min；室温条件下,显色时间为TMB显色液作用10min。绘制出的ci-ELISA DES-Kit的标准曲线显示为典型的S型,与4参数logit曲线拟合相符,IC50为0.49ng/mL,检测限为0.5 ng/mL;阴性的鲫鱼肉、猪肉平均回收率分别为79.3%和81.63%,平均变异系数(CV)分别为9.28%、8.70%,平均批内CV分别为9.7%、9.3%,平均批间CV分别为7.6%、7.0%,平均批内CV和平均批间CV均小于10%；与HEX和DIEN的CR%分别为6.53%、3.42%,与其他竞争物没有CR；在4℃、避光条件下,DES-Kit可存放6个月。4.建立了胶体金的制备条件：以柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)作为还原剂,1.0%的氯金酸与1.0%的Na3c6H5O7·2H2O最佳的作用剂量比为1mL:1.7 mL,金颗粒直径为25 nm；胶体金标记DES McAb的最佳标记浓度为7.2 μg/ml。应用胶体金免疫层析试验(GICA)原理和获得的DES McAb制备DES-Strip, DES-Strip的标准曲线显示为典型的S型,机读检测限为0.25 μg/L,目测检测限为2.0μg/L,10min内即可完成测定,与其类似物没有CR,在4℃干燥条件下DES-Strip的保存期为9个月。5. HPLC的确证检测显示,DES-Kit与HPLC的差异为2.7%～4.3%,DES-Strip与HPLC的差异为1.5%-4.9%；GC-MS的确证检测显示,DES-Kit与GC-MS的差异为1.4%～4.1%,DES-Strip与GC-MS的差异为1.0%-4.6%,实验结果表明,4种方法的测定结果无明显差异,测定结果基本相同。
[Abstract]:A rapid , simple , sensitive , accurate and low cost method was used to detect DES - BSA and DES - BSA . The results showed that the IC50 of DES - OVA was 3.38 脳 109 , 9.27 脳 109 , 2.30 脳 109 , 1.87 脳 1010 L / moL , respectively . The average CV and CV were 9.28 % and 8.70 % , respectively . The average CV and CV were 7 . 6 % and 8 . 70 % , respectively . The mean CV and CV were 7 . 6 % , 3 . 42 % , respectively . By HPLC , the difference between DES - Kit and HPLC was 2.7 % ~ 4.3 % , the difference between DES - Strip and HPLC was 1.5 % - 4.9 % . The difference between DES - Kit and GC - MS was 1.4 % ~ 4.1 % , and the difference between DES - Strip and GC - MS was 1.0 % - 4.6 % .

【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S859.84

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