天祝白牦牛KAP家族基因克

发布时间：2018-02-19 18:06

本文关键词： 牦牛绒毛角蛋白关联蛋白实时荧光定量PCR 原核表达　出处：《西北民族大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：牦牛以全身密生长毛及绒毛而得名,是唯一产绒的牛种,天祝白牦牛是特有的产白色绒毛的品种,由于白色绒毛有利于染色,因此降低了纺织业中染色的难度。角蛋白关联蛋白(KAP)作为主要的绒毛蛋白,在绒毛的生长中起着重要作用。本试验旨在通过研究KAP家族蛋白为筛选控制绒毛生长的主效基因奠定一定的基础。该研究选取了KAP家族的四个基因KAP1.1, KAP3.1,KAP11.1和KAP13.1作为研究对象。根据相应的四个基因在Genbank中寻找报道的黄牛的序列设计它们的引物,通过PCR扩增的手段得到这四个基因的目的片段,运用TA克隆技术获得其完整编码区(CDS)序列并使用生物信息学软件对基因进行分析。将克隆得到的目的片段转入表达载体并用大肠杆菌(E.coil)表达蛋白质。运用Real-time PCR技术检测天祝白牦牛KAP家族基因在绒毛生长期和休止期皮肤组织中这四个基因之间的表达差异。研究结果如下：(1)通过TA克隆得到了KAP1.1,KAP3.1, KAP11.1口KAP13.1基因的完整CDS区序列。KAPl.1基因完整的编码区长度为501bp,所编码的蛋白质含有166个氨基酸；该蛋白属于亲水性蛋白,含有High sulphur keratin-associated protein家族蛋白的完整结构域,共含有6个磷酸化位点,该蛋白在线粒体上发挥生物学作用,二级结构含有α螺旋,延伸链,p转角,无规卷曲四种结构；KAP3.1基因完整的编码区长度为297bp,所编码的蛋白质含有98个氨基酸,该蛋白属于亲水性蛋白,含有Keratin, high sulphur matrix protein家族蛋白的结构域,共含有5个磷酸化位点,该蛋白在细胞核和细胞质中发挥生物学作用,二级结构含有延伸链,p转角,无规卷曲三种结构；KAP11.1基因完整的编码区长度为480bp,所编码的蛋白质含有159个氨基酸,该蛋白属于亲水蛋白,含有完整的Keratin-associated protein家族蛋白的结构域,共含有18个磷酸化位点,该蛋白在线粒体上发挥生物学作用,二级结构含有延伸链,无规卷曲两种结构；KAP13.1基因完整的编码区长度为495bp,所编码的蛋白质含有164个氨基酸,该蛋白属于亲水蛋白,共含有25个磷酸化位点,该蛋白在细胞核上发挥生物学作用,含有完整的Keratin-associated protein家族蛋白的结构域,二级结构含有延伸链,β转角,无规卷曲三种结构。(2)将pET28a质粒载体和KAP家族基因结合形成原核表达载体,实现其在原核生物大肠杆菌的表达。通过SDS-PAGE分析结果显示KAP1.1、KAP3.1、KAP11.1以及KAP13.1的目的片段大小与预期一致；通过Western Blot方法发现目的片段有放射性反应,证明抗体与目的片段结合,从而验证了SDS-PAGE分析结果的正确性,通过以上试验证明得到的蛋白是KAP家族蛋白,并证明了克隆得到的基因是目的基因,得到了蛋白样本,为后续试验提供样本支持。(3)运用Real-time PCR技术对KAP家族基因在天祝白牦牛绒毛生长期和休止期的表达量进行分析,在生长期KAP家族基因除KAP1.J1和KAP13.1之间没有显著性差异外(P≥0.05),其他基因之间都有极显著性差异(P0.01)。并且KAP1.1基因在绒毛生长期表达量最高,而KAP11.1表达量最低。而在绒毛的休止期的K4P家族基因之间表达都有极显著性差异(P0.01)。KAP13.1基因在绒毛的休止期表达量最高,而KAP3.1基因表达量最低。通过生长期和休止期KAP家族基因表达差异的比较,本研究发现KAP3.1基因在生长期的表达量明显高于休止期,说明KAP3.1基因在绒毛生长中起到促进作用。而其他三个基因则是休止期高于生长期,说明KAP1.1.KAPi1.1和KAPl3.1基因在绒毛生长中起到抑制作用。而KAP13.1基因在休止期和生长期的表达差异量要明显高于其他两个基因,因此KAPl3.1基因在抑制绒毛的生长方面起到更重要的作用。
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【学位授予单位】：西北民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S823.85

【参考文献】