猪圆环病毒新型细胞穿透肽的发现及其作用机制的研究

发布时间：2018-02-21 11:38

  本文关键词： 猪圆环病毒 穿透肽 核定位信号 侵染机制 内吞途径 TAT蛋白　出处：《湖南农业大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：猪圆环病毒(Porcine Circovirus,PCV)属于圆环病毒科,圆环病毒属,单链环状DNA病毒,分为猪圆环病毒1型和猪圆环病毒2型两个亚型,其中1型不致病,2型能引起猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus diseases, PCVDs)。本文以猪圆环病毒为主要研究对象,重点对猪圆环病毒的核定位信号(Nuclear localization signal,NLS)功能区域进行了全面的研究。圆环病毒的核定位信号功能区域,即N端的41个氨基酸,位于病毒颗粒的内部,与病毒遗传物质相连,除了有核定位的作用以外,暂无相关研究明确表明其具有其它作用。本文从病毒的氨基酸序列出发,通过序列比对分析,发现其具有大量的带正电荷的氨基酸精氨酸,由此我们提出假设——PCV2的核定位信号区域具有细胞穿透肽的作用,即具有细胞膜透性。为了证明以上假设,首先我们将PCV2 Cap NLS区域与绿色荧光蛋白eGFP融合后表达纯化得到蛋白PCV2-NLS-eGFP,然后侵染细胞,发现该蛋白PCV2-NLS-eGFP能进入PK15细胞和SF9细胞,同时我们将核定位细胞的41个氨基酸按照精氨酸富集情况分成两部分,进行人工合成,前20个氨基酸组成的多肽命名为NLS-A,后面21个氨基酸则命名为NLS-B,并分别在其N端用绿色荧光染料FITC修饰,发现多肽NLS-A能有效的携带绿色荧光燃料FITC进入细胞,NLS-B则不能。在观察NLS-A进入细胞的过程中,我们发现实验组NLS-A侵染的细胞的荧光强度要比阳性对照TAT侵染的细胞强,所以接下来我们进一步通过流式细胞分析技术对相同摩尔浓度的多肽NLS-A和经典的细胞穿透肽TAT携带FITC进入细胞的效率进行比较分析,发现NLS-A携带FITC进入细胞的效率要高于TAT；同时我们也对NLS-A进入细胞的机制进行了相关的研究,在相对较低的浓度时(10μ M以下时),NLS-A主要通过一些传统的endocytosis的途径进入细胞,而在相对较高的浓度时(10μM以上时),NLS-A除了通过传统的内吞途径进入细胞外,还存在一种快速进入细胞的方式,目前还没有有利的证据证明该方式的详细机制。TAT蛋白作为一类经典的细胞穿透肽,自从发现以来在药物传送以及疾病治疗中有许多重要的研究,由此可以推断NLS-A将会在这方面具有重大的应用潜能。猪圆环病毒的核定位信号作为其衣壳蛋白的一部分,参与病毒颗粒的组成,本文对其核定位信号是一种穿透肽的证明,也说明了PCV2的NLS功能区有可能在病毒的侵染过程中起着重要作用。
[Abstract]:Porcine Circlip ( PCV ) belongs to the family of circular viviridae , circular ring virus and single - stranded circular DNA . It is divided into two subtypes of porcine cirrovirus type 1 and porcine cirque type 2 , among which type 1 is not pathogenic , and type 2 can cause porcine reproductive diseases ( PCVDs ) . In order to prove the above hypothesis , we find that the nuclear localization signal region of the experimental group has a large amount of amino acid arginine with positive charge . In addition to the function of nuclear localization , we find that the nuclear localization signal region of the experimental group has a large amount of amino acid arginine with positive charge .

【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.651

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本文编号：1521880