H9N2亚型AIV受体结合特性分析及内部基因对致病性影响的研究

发布时间：2018-03-07 06:03

本文选题：H9N2亚型禽流感病毒　切入点：受体结合位点　出处：《山东农业大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：近十几年来,禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)特别是H9N2亚型AIV在中国广泛流行,给中国养禽业造成巨大的经济损失。已有研究发现,H9N2亚型AIV不经适应即可感染哺乳动物,包括小鼠、豚鼠、雪貂、恒河猴等实验动物以及家猫、家犬等伴侣性动物。更重要的是,我国已发生H9N2亚型禽流感感染人的事件。血清学调查也显示,我国农场从业人员的血清中抗H9亚型流感病毒的阳性率达2.3%-13.7%。上述现象说明H9N2亚型AIV已经获得跨越种间屏障进而感染哺乳动物甚至是人的能力,因而具有引发新的流感大流行的潜在威胁。在广泛流行的同时,H9N2亚型AIV作为新发流感病毒的基因节片供体为其它亚型AIV提供了多个基因节片。如1997年香港流行的H5N1亚型流感病毒,其内部基因可能来源于A/Quail/Hong Kong/G1/97(H9N2)分离株,而2013年流行的H7N9亚型AIV的内部基因全部来自H9N2亚型AIV。因此,加强对中国H9N2亚型AIV跨种感染与致病机制研究,对保障养禽业发展和保护人类健康具有重要的现实意义。本研究从分析H9N2亚型AIV的受体结合特性与致病机制入手,主要进行了以下两方面的工作:首先,分析了中国近十几年间流行的H9N2亚型AIV受体结合特性。我们分析了中国1999~2014年间在NCBI上提交的H9N2亚型AIV的HA序列与病毒受体结合能力有关的HA蛋白第226位点,同时对相应病毒株的宿主分布进行了统计。结果表明,中国流行的H9N2流感病毒其HA-226位点已呈现出遗传演化的多样性,除了常见的L和Q位点外,又出现了M和F,其所占比率分别为81.85%、17.57%、4.81%和0.11%;宿主分布结果表明,中国的H9N2亚型AIV绝大部分来自于禽类,剩下的分别来自于猪和人,其所占比率分别为97.92%、1.81%和0.27%。另外,分别利用鸡红细胞法和固相ELISA方法对实验室保存的三株H9N2亚型AIV的受体结合能力进行了检测。结果表明,具有HA-226L的病毒(CK/JN/3)只具有结合SAα2,6Gal的能力;具有HA-226Q的病毒(CK/JL/6)只具有结合SAα2,3Gal的能力;而具有HA-226F的病毒(CK/JN/2)则具有双重受体结合特性。而当前中国家禽中所流行的H9N2亚型流感病毒以具有结合SAα2,6Gal的病毒为主。上述结果说明中国H9N2亚型AIV大部分毒株已具备了识别人样流行病毒受体的能力,在哺乳动物间流行的风险在加大。另一方面,本实验分析了H9N2亚型AIV内部基因突变对病毒致病性的影响。利用点突变技术将在小鼠适应株中发现的内部基因3个氨基酸突变位点(PB2-E627K、HA-N313D和HA-N496S)依次引入到母本野生株A/Chicken/JN/Li-2/2010(H9N2)相应的基因序列中。通过反向遗传操作技术获得具有一个或多个突变位点的病毒株。结果表明,与母本毒相比,PB2-E627K突变位点的出现使病毒在MDCK细胞和小鼠肺脏内的复制能力均增强,且差异显著(p0.05);而只具有HA-313D/496S病毒株的复制能力与母本毒株相似。在致病力方面,以106EID50攻毒小鼠时,具有PB2-E627K的病毒对小鼠的致死性增强,其MLD50至少提高了316倍;而母本毒与只具有HA-313D/496S的病毒株并不对小鼠致死。106EID50攻毒小鼠后肺脏病理检测结果表明,具有PB2-E627K病毒的小鼠肺脏病变集中在小血管和细支气管周围,伴有水肿和炎性细胞浸润,而母本毒与具有HA-313D/496S的病毒株对应的小鼠肺脏并无明显的病理变化。聚合酶活性分析发现,具有PB2-E627K的毒株聚合酶活性至少提高了16倍,与母本毒相比差异显著。病毒的酸、热稳定性未见明显变化。以上结果说明,PB2-E627K是鼠适应株致病性增强的关键氨基酸位点,并通过聚合酶活性的提高影响了病毒对宿主的致病性。受体结合特性与致病性分析结果表明,H9N2亚型AIV具备了识别人类上呼吸道流感病毒受体的能力,并可通过单个氨基酸的突变获得对哺乳动物的高致病性。本研究上述结果为进一步探索H9N2亚型AIV在哺乳动物间致病和传播的分子机制奠定基础。
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【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

【共引文献】