6种靶向分子对FaeG-mSTa-LTb-STb融合蛋白包涵体口服免疫效果的影响

发布时间：2018-03-07 19:47

本文选题：产肠毒素性大肠杆菌　切入点：四价融合抗原　出处：《东北农业大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：断奶仔猪腹泻是影响养猪业发展的重要疾病,其发病率高,危害相当严重,会带来严重的经济损失,已经成为全球养猪产业中的一个难题。产肠毒素性大肠杆菌则是造成断奶仔猪腹泻的重要病原体,根据近年的流行病学调查显示,在菌毛基因中,F4+ETEC占据优势地位。在肠毒素基因中,STa、STb、LT是最重要的毒力因子。目前应对仔猪腹泻主要依靠药物治疗,其中大多数为抗生素类药物,抗生素类药物容易产生耐药性,并且滥用抗生素对仔猪产生极大的影响,所以,研制开发出经济、有效的疫苗来预防断奶仔猪腹泻是极其必要的。本研究首先采用融合PCR的方法得到Fae G-m STa-LTb-STb四价抗原基因,并将该融合基因连接到pPro EXHTa表达载体中,转化入大肠杆菌BL21,诱导表达。经SDS-PAGE、Western blot分析显示,融合基因在大肠杆菌中获得了高效表达并以包涵体形式存在,并且具有反应原性。为研究融合蛋白的免疫原性,本实验利用提取纯化后的包涵体直接口服免疫BALB/c小鼠,分别测定免疫后不同时间血清中的特异性Ig G、Ig M和粪便中特异性的s Ig A抗体水平,并进行脾淋巴细胞增殖实验,攻毒后从粪便检测排菌的持续时间,在末次免疫3个月后,测定黏膜免疫记忆反应。结果显示,免疫小鼠均产生了特异性抗体和细胞免疫应答,攻毒后排菌时间明显缩短。免疫记忆反应试验表明,免疫鼠至少在3个月内保持着对特异性抗原的免疫记忆应答,证实了包涵体作为口服疫苗的传递载体是有效的。为了提高该四价抗原基因的免疫效果,本研究利用PCR的方法分别在该融合基因的3’端加入C5a L、Cpe17、Cpe30、Yad A3、sfimH的靶向分子,用于增强抗原传递效率,加强免疫效果,在单靶向基因构建成功后,同样利用PCR的方法,在该各组单靶向抗原的5’端加入DCpep靶向分子,构建双靶向融合基因,靶向树突状细胞,更进一步增强免疫效果。利用SDS-PAGE、Western blot方法分析各单、双靶向分子组,各重组基因均可在大肠杆菌中的高效表达,并以包涵体的形式存在,具有反应原性。为了比较不同靶向分子之间的免疫效果,选择增强效果最好的靶向分子,本实验口服各组包涵体免疫BALB/c小鼠,分别测定免疫后不同时间血清中的特异性Ig G、Ig M和粪便中特异性的s Ig A抗体水平,并进行脾淋巴细胞增殖实验,攻毒后检测粪便排菌的持续时间。结果显示,除sfimH靶向分子组外,其它单、双靶向分子组抗体水平显著高于无靶向组。但单、双靶向分子组之间相似,除Yad A3组外,其他组单、双靶向分子之间无明显抗体水平差异。攻毒后各组特异性抗体水平均有升高,各组小鼠排菌时间比对照组均明显缩短。脾淋巴细胞增殖结果表明,各实验组增殖刺激指数均极显著高于对照组。这说明了C5a L、Cpe17、Cpe30、Yad A3靶向分子具有免疫增强的功效。但这些靶向分子与DCpep靶向分子不全具有协同作用,只有Yad A3靶向分子与DCpep靶向分子具有协同作用,从而更好的提高了免疫效果。在选择最好的靶向分子组合后,我们进行了仔猪免疫实验,分别通过口服免疫、鼻腔滴鼻免疫、注射免疫三种不同的方式进行免疫,经过两次免疫后进行攻毒实验,在二免后7d、攻毒后7d分别对各组免疫方式的仔猪进行前腔静脉采血,利用间接ELISA的方法测定血清中的Ig G抗体水平。并在攻毒实验前后观察仔猪发病情况、粪便排菌情况、日增重情况。结果表明,在二免7d后及攻毒7d后,各实验组仔猪均产生了较高的特异性抗体水平,相比于对照组差异极显著(**p0.01)。其中口服Yad A3-DT组抗体水平明显高于口服无靶向组,差异极显著(**p0.01)。攻毒后,对照组发病快,腹泻明显,而免疫组发病现象不明显,无腹泻出现,并且排菌时间明显比对照组短,日增重多。这说明了该四价融合抗原在三种不同的免疫方式下均可在仔猪体内诱导较高水平特异性免疫反应,在一定程度上可以保护仔猪不被ETEC感染,并且双靶向分子免疫增强作用得到了证实。综上所述,本实验构建的Fae G-mSTa-LTb-STb四价抗原具有良好的免疫原性,证实了口服包涵体免疫是一种可行的免疫方式,各种靶向分子均有一定的免疫增强作用,这表明了该重组蛋白作为口服疫苗抗原具有潜在的应用价值,为下一步开发新型的ETEC口服疫苗奠定了基础。
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【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.4

【参考文献】