牛精子MicroRNA的筛选鉴定及其对胚胎早期发育影响的初步研究

发布时间：2018-03-10 11:38

本文选题：精子RNA　切入点：高通量测序　出处：《西北农林科技大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：在传统的观念中,精子的主要作用是给后代提供父源基因组和之后激活胚胎的受精发育,卵母细胞负责调控胚胎发育,这种片面的理解就导致长时期以来人们把目光过多的放在卵母细胞上,而忽略了对精子的认识。在受精过程中,蛋白质、小的非编码RNA、mRNA等都会被带入卵母细胞中,进而对雌雄原核形成、卵裂球分裂时空的顺序、合子基因转换、胚胎发育乃至后代表型等都具有重要的意义,也就意味着精子参与了早期胚胎发育和介导核进行重编程等一系列过程。因此对受精过程中被带入卵母细胞的成分进行细致的研究有助于解开发育生物学领域的关键性难题。本研究的主要目的是构建精子,卵母细胞和体细胞的小RNA高通量表达文库,筛选出精子差异性表达的miRNA(microRNA)。基于此,探索出一套高效提取高质量精子RNA的方法是研究其内容物和构建小RNA表达文库的基础。精子是高密度的浓缩体,携带RNA量极少,因此从精子内容物中提取RNA难度颇大。此外,由于睾丸中成熟精子量少、鲜精成本高和冻精活力低,我们往往需要额外精细的提取步骤和RNA质控从而保证提取的RNA的浓度和完整性,并且通过RT-PCR检测提取出的RNA质量。采用Solexa高通量测序技术结合生物信息学进行筛选牛精源性高表达的miRNA并且将其外源模拟物注入卵母细胞,或以诱导表达的方式赋予体细胞精子水平,探索精源性miRNA对早期胚胎发育水平的影响。(1)创新合理的从牛附睾尾部采精并进一步获能纯化,之后通过不同方法与实验条件摸索出提取牛精子RNA最优化的方法,通过qRT-PCR对提取的精子RNA进行了特征性基因及完整性检测。实验从附睾中分离精子并通过上游获能收集纯化成熟的精子,并用加热到60℃的TRIzol裂解液提取精子RNA,实验表明可保证较好的纯度和完整度;(2)通过Illumina高通量测序建立成熟精子的小RNA文库,同时对相应的靶基因和通路进行了预测和分析。在miRBase2.0中将18-26 nt的Unique序列比对到相应特异性的前体上,共检测到951个已知的miRNA和8个新的高表达候选miRNA。精源性的miRNA数据库对胚胎发育、表观遗传学功能和分子机制分析提供了基本但十分重要的数据基础;(3)从三个样本高通量测序文库(牛皮肤成纤维细胞、MII期卵母细胞和成熟获能后精子)中筛选得到了精子特异性表达的miRNA作为初步候选,通过实时荧光PCR验证排除测序实验结果的假阳性,进一步对所获得的miRNA数据进行分类注释和表达模式分析,GO富集性分析和KEGG通路分析。以精子所携载的miR-202为研究对象,通过外源显微注射miRNA模拟物进入卵母细胞的形式,模拟正常受精中精子外源带入miR-202的表达水平,通过卵裂率和乙酰化水平检测,发现它可以提高胚胎发育和核的重编程能力。(4)构建miR-449b的Tet-On 3G诱导表达载体,实验组为经过筛选的克隆阳性细胞经强力霉素(Doxycycline,Dox)诱导后作为供体细胞进行体细胞核移植,不经过Dox诱导的为对照组。结果表明赋予供核体细胞以精子样的miR-449b水平,显著提高牛体细胞核移植,胚胎的体外发育和核的重编程能力。
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【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S814

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