鹅细小病毒传代致弱毒株的培育及胶体金免疫层析检测方法的建立

发布时间：2018-03-10 14:01

  本文选题：鹅细小病毒　切入点：分离鉴定　出处：《中国农业科学院》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：鹅细小病毒病是由鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)引起的,该病是一种主要侵害4~20日龄雏鹅和雏番鸭的急性或亚急性败血症,具有高度传染性,以发生渗出性肠炎为主要特征。该病传播快,病死率高,5日龄以内雏鹅感染,死亡率高达95%以上。鹅细小病毒病的传播和流行对我国养鹅业造成了重大经济损失,严重制约着我国养鹅业的健康发展。本研究从小鹅瘟疑似病例中分离到一病原,经过PCR鉴定、IFA鉴定和动物回归试验,确定该病原为GPV并将其命名为GPV YG株。通过将GPV YG株在鹅胚成纤维细胞(GEF)和鸭胚成纤维细胞(DEF)上进行交替传代培养,当病毒在GEF上传至第12代时,开始出现细胞病变;IFA检测发现,随着病毒感染时间的延长,感染细胞数量呈现先增加随后减少的变化趋势,感染后第96 h阳性细胞数量最多;病毒的滴度随着传代次数的增加而逐渐升高,当病毒在GEF上传至第50代时,GPV YG株细胞适应毒毒价为106.5 TCID50/m L。雏鹅致病性试验结果显示,第50代病毒毒力明显减弱,表现为感染雏鹅死亡和发病率降低,且死亡雏鹅无鹅细小病毒病的特征性病变及临床表现。对接种了第50代病毒的雏鹅粪便进行PCR检测后发现,接种后的第3天至第21天,雏鹅所排粪便内均能检测到GPV抗原,这表明GPV传代致弱毒株能够在雏鹅体内持续增殖,并向外界环境排毒。易感雏鹅在接种GPV传代致弱毒株后,体内开始产生中和抗体,并且抗体滴度随着时间的增长而逐渐升高,在接种后第4周,中和抗体滴度可达10-2.55/0.2m L,之后抗体滴度有所下降。对F0代和F50代病毒的全基因组序列和推导氨基酸序列进行比对,结果显示与F0代相比,F50代病毒共有89个核苷酸突变位点,主要位于VP基因;以及19个氨基酸突变位点,其中5个位于NS蛋白,14个位于VP蛋白。在F50代基因组5’端和3’端非编码区,分别有一段碱基的插入,大小都为9nt。此外,为建立一种快速、简便、灵敏的GPV胶体金免疫层析检测方法,本研究采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,将其标记于纯化的抗GPV VP3蛋白的单克隆抗体(m Ab)2D5,在硝酸纤维素膜上喷涂纯化的抗GPV VP3蛋白m Ab 4A8和羊抗鼠Ig G抗体,分别作为检测线和质控线,制成检测GPV的胶体金免疫层析试纸条。结果表明,所制备的GPV检测试纸条的最低检测限度为104.15TCID50/m L;用制备的试纸条检测GPV为阳性,而检测其他主要水禽病病原均为阴性;同一批次和不同批次的试纸条对GPV阳性样品的检测结果均无差异;使用试纸条对已知的80份粪便样品进行检测,阳性及阴性样品的检测符合率分别为96.49%和100%。本研究成功分离到了一株GPV,并将其命名为YG株。通过将YG株在GEF与DEF上交替传代培养,得到了毒力明显减弱的YG株细胞适应毒,这为今后GPV弱毒苗的研制奠定了基础。此外,本研究所制备的GPV胶体金免疫层析检测试纸条具有良好的特异性、敏感性和重复性,为“小鹅瘟”的快速诊断提供了新的方法。
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【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

【引证文献】

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 刘岳龙;孙志;李清;孙谦;秦爱建;金文杰;邵红霞;;小鹅瘟强毒CZ株的细胞适应毒的培育和部分生物学特性的测定[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届全国会员代表大会暨第11次学术研讨会论文集[C];2005年

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本文编号：1593649