抗牛传染性鼻气管炎病毒囊膜gD糖蛋白单链抗体的制备与特性鉴定

发布时间：2018-03-13 16:29

  本文选题：牛传染性鼻气管炎病毒　切入点：gD蛋白　出处：《江西农业大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)又名牛疱疹病毒Ⅰ型(Bovine hepersvirusⅠ,BHV-1),是引起牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)的病原,自20世纪50年代美国首次报道以后,已在世界范围内广泛分布,给养牛业造成了很大的经济损失。gD蛋白是牛传染性鼻气管炎病毒的囊膜糖蛋白,能够诱导产生中和抗体。但由于病毒能潜伏于荐神经节及三叉神经节,常规抗体难以进入细胞而无法清除病毒。随着单链抗体的发展及应用,可有效解决此难题,单链抗体是一种小分子的基因工程抗体,由抗体的重链可变区和轻链可变区通过一段连接肽连接而成,是抗原结合的最小功能单位,其分子量小、穿透能力强,可穿透血管壁进入靶组织。本研究利用自行设计的兼并引物,以PCR方法从杂交瘤细胞的cDNA中扩增单链抗体重链可变区基因和轻链可变区基因,通过重叠延伸PCR及Linker序列获得完整的单链抗体基因。运用大肠杆菌及昆虫细胞分别表达单链抗体基因。用大肠杆菌表达时,将单链抗体基因克隆至pET28a质粒构建表达载体,转化大肠杆菌BL(DE3)诱导表达,表达的单链抗体蛋白大小为30kD,能特异性结合抗His单克隆抗体。进一步对以包涵体形式的表达产物进行变性、纯化和复性后,获得了单链抗体融合蛋白。Western blot、抗原捕获ELISA、IFA的结果均表明该单链抗体蛋白能够特异性地与IBR病毒抗原结合。微量病毒中和试验及噬斑减数试验进一步显示,该单链抗体蛋白能和IBR病毒发生中和反应,并可以有效地抑制病毒在牛肾细胞(Madin-darby Bovine Kidney,MDBK)中复制;用昆虫细胞表达时,将单链抗体基因克隆至转移载体pFastBac-Lic-Bse中,构建重组转移载体pFB-VH-VL,将其转化至DH10Bac感受态细胞中获得重组rBacmid-VH-VL,并转染至Sf9细胞中获得单链抗体蛋白,分子大小约为30 kD。Western blot结果显示昆虫细胞表达的单链抗体蛋白,不仅能被抗His标签的抗体识别,而且能特异性结合IBRV gD蛋白。间接免疫荧光试验结果表明该单链抗体蛋白能够识别感染MDBK的IBRV。通过比较研究,以两种表达系统均能制备出单链抗体蛋白,但大肠杆菌表达的单链抗体对牛传染性鼻气管炎病毒和gD蛋白均具有更强的结合能力和抗病毒活性。鉴于其制备简单且成本低廉,该单链抗体将在未来开发牛传染性鼻气管炎的特异性诊断方法和有效的治疗药物时,提供物质基础。
[Abstract]:Bovine bovine rhinotracheitis virus (IBRV), also known as bovine herpesvirus type I hepersvirus 鈪，

本文编号：1607204