牛1型腺病毒感染性克隆的构建及拯救

发布时间：2018-03-13 17:47

  本文选题：牛1型腺病毒(BAdV1)　切入点：感染性克隆　出处：《西北农林科技大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：人5型腺病毒(HAdV5)目前已作为一种优秀的载体广泛用于基因治疗和疫苗研究。但是由于人群中普遍存在的HAdV5载体免疫,HAdV5载体的应用受到很大限制。为克服HAdV5存在的以上缺陷,目前主要通过两个途径来解决。一是从病毒改造或替代角度解决,包括HAdV5衣壳改造、使用HAdV稀有血清型、使用动物腺病毒等。二是通过黏膜途径免疫,主要为口服和滴鼻免疫。在病毒改造或替代方面,由于动物腺病毒与人腺病毒之间没有交叉免疫反应,因此可作为HAdV5的理想替代载体。在黏膜免疫途径方面,考虑到滴鼻免疫被报道存在神经毒性,口服免疫安全便捷,因此可用于口服的腺病毒疫苗载体近年来受到广泛的关注。牛1型腺病毒(BAdV1)分离自健康牛肠道,与人腺病毒之间无血清交叉反应,同时在肠道具有高稳定性,基于BAd V1的疫苗载体可同时从两个途径克服HAdV5载体应用瓶颈。因此本研究首次尝试构建基于健康牛肠道1型腺病毒的载体系统——BAdV1感染性克隆,后续有望用于BAdV1的基因功能研究和基于BAd V1载体的基因治疗和口服疫苗研究。本研究主要分为2部分:1.通过细菌同源重组构建BAdV1感染性质粒本研究首先根据BAdV1的基因序列合成含有I-SceI限制性内切酶识别位点的LITR和RITR,并分别和扩增的BAdV1 E1及E4片段进行overlap PCR获得BAdV1的左右同源臂(LITR+E1和RITR+E4),随后分别克隆到pUC18载体上经测序表明成功构建了穿梭质粒pUC18-E1-E4。野生型BAdV1在VIDO DT1细胞上扩增后,提取线状病毒基因组。Afl II线性化的pUC18-E1-E4质粒通过与提取的BAdV1基因组在大肠杆菌BJ5183中同源重组,经限制性酶切图谱分析表明成功构建了在BAdV1全基因组引入I-SceI酶切位点的BAdV1感染性质粒pUCBAdV1。2.重组病毒BAdV1在VIDO DT1细胞上的拯救环状重组基因组pUCBAdV1转染能够表达I-SceI内切酶的VIDO DT1细胞后成功包装并传代了重组BAdV1。这也证实了VIDO DT1可以拯救并增殖BAdV1。此外,重组BAdV1和wtBAdV1在VIDO DT1细胞增殖能力相当都能达到较高的滴度,表明本研究构建的BAdV1的重组载体系统可为其将来载体疫苗的开发研究奠定了重要的基础。
[Abstract]:Human adenovirus type 5 (HAdV5) has been widely used as an excellent vector for gene therapy and vaccine research. However, the application of HAdV5 vector, which is widely used in the population, has been greatly restricted. In order to overcome the above defects of HAdV5, human adenovirus type 5 (HAdV5) has been widely used in gene therapy and vaccine research. At present there are two main ways to solve the problem. One is from the perspective of virus transformation or substitution, including the transformation of HAdV5 capsid, the use of rare serotypes of HAdV, the use of animal adenovirus, etc. The other is immunization through mucosal channels. Mainly oral and nasal immunization. In virus modification or substitution, because there is no cross immune reaction between animal adenovirus and human adenovirus, it can be used as the ideal alternative vector of HAdV5. In view of the reported neurotoxicity of nasal drip immunization and the safety and convenience of oral immunization, the vector of adenovirus vaccine which can be used in oral administration has attracted wide attention in recent years. Bovine adenovirus type 1 (BAdV1) is isolated from healthy bovine intestines, There is no serum cross reaction with human adenovirus and high stability in the intestine. The vaccine vector based on BAdV1 can overcome the bottleneck of HAdV5 vector application from two ways at the same time. Therefore, this study is the first attempt to construct the vector system of BAdV1 infectious clone based on healthy bovine enterotype 1 adenovirus. This study is mainly divided into two parts: 1. Construction of BAdV1 infectious plasmids by homologous recombination of bacteria. The first step of this study was to construct BAdV1 infectious plasmids based on BAdV1. Sequence synthesis of LITR and RITR containing I-SceI restriction endonuclease recognition site, and overlap PCR with amplified BAdV1 E1 and E4 fragments to obtain LITR E1 and RITR E4 of BAdV1, respectively, were cloned into pUC18 vector and sequenced. The shuttle plasmid pUC18-E1-E4was successfully constructed. The wild type BAdV1 was amplified on VIDO DT1 cells. The linearized pUC18-E1-E4 plasmid of linear virus genome. AflII was homologous recombined with the extracted BAdV1 genome in Escherichia coli BJ5183. Restriction endonuclease map analysis showed that the BAdV1 infectious plasmid pUCBAdV1.2was successfully constructed by introducing I-SceI restriction site into the whole BAdV1 genome. The recombinant virus BAdV1 was transfected into VIDO DT1 cells to express I-SceI endonuclease. VIDO DT1 cells were successfully packaged and subcultured into recombinant BAdV1.This also confirmed that VIDO DT1 could save and proliferate BAdV1.In addition, Both recombinant BAdV1 and wtBAdV1 could achieve high titers in VIDO DT1 cells, indicating that the recombinant vector system of BAdV1 constructed in this study could lay an important foundation for the development and study of vector vaccine in the future.
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S855.3

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本文编号：1607462