犬瘟热病毒M、F、H基因重组杆状病毒的构建、鉴定与表达研究

发布时间：2018-03-27 18:50

本文选题：犬瘟热病毒　切入点：基质膜蛋白　出处：《吉林农业大学》2015年硕士论文

【摘要】：近年来,病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)作为一种同时兼顾安全性和免疫原性的疫苗形式逐渐成为病毒疫苗研究热点和未来发展趋势之一。研究表明副黏病毒基质蛋白M是VLPs形成和出芽的主要驱动力,与表面糖蛋白(F、H)共表达后可以形成VLPs且大小与真实病毒粒子相似,同时可保证有足够的保护性抗原。因此,具有天然构象的M、F和H蛋白的表达是犬瘟热病毒VLPs组装的前提条件。本研究基于杆状病毒-昆虫细胞表达系统分别构建了表达犬瘟热病毒M、F和H蛋白的重组杆状病毒,并通过原核表达蛋白制备鼠抗M、F、H蛋白及兔抗H蛋白多克隆抗体,对各重组杆状病毒在昆虫细胞中目的蛋白的表达分别进行了鉴定,为包装犬瘟热病毒VLPs奠定了物质基础。主要研究内容如下:1、犬瘟热病毒M、F和H蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备1、犬瘟热病毒M、F和H蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备以小熊猫源犬瘟热病毒驯化致弱株LP为研究对象,分别针对其M、F和H蛋白的主要抗原表位区设计克隆引物,通过RT-PCR扩增去除跨膜区和信号肽序列而保留主要抗原表位区片段,将编码序列大小分别为1005 bp、1050 bp和1104 bp的CDV M、F、H基因片段分别克隆至原核表达载体p ET-30a(+)中,构建重组质粒p ET-30a(+)-M、p ET-30a(+)-F和p ET-30a(+)-H。将各表达质粒转化宿主菌BL21(DE3),在0.4m M IPTG和37℃条件下诱导表达4 h后,经SDS-PAGE分析结果显示重组质粒p ET-30a(+)-M、p ET-30a(+)-F和p ET-30a(+)-H在大肠埃希菌中分别诱导表达出分子质量为43 ku、40 ku和46 ku的重组蛋白,大小与预期相符,主要以不溶性包涵体形式存在。Western blot鉴定结果显示M、F、H重组蛋白均能被犬抗CDV多克隆抗体特异性识别。以经Ni-NTA亲和层析纯化后的M、F和H重组蛋白分别免疫BALB/c小鼠和兔,经3次免疫后采血,分离血清,制备鼠抗CDV M、F和H蛋白多克隆抗体及兔抗H蛋白多克隆抗体。2、犬瘟热病毒M、F和H蛋白重组杆状病毒的构建、鉴定与表达为构建表达具有天然构象的犬瘟热病毒M、F和H蛋白,分别将CDV LP弱毒株M、F和H基因ORF克隆至p Fast Bac?1载体中,测序验证后转化至DH10Bac?感受态细胞,同源重组获得穿梭质粒r Bacmid-M、r Bacmid-F和r Bacmid-H,将其分别转染Sf9细胞获得相应重组杆状病毒rp FB-M、rp FB-F和rp FB-H。分别以上述制备鼠抗CDV M、F和H蛋白多克隆抗体及兔抗H蛋白多克隆抗体对相应重组杆状病毒进行IFA鉴定,结果显示各重组病毒在感染细胞的细胞膜上均可见特异性荧光反应;同时,对各重组杆状病毒感染细胞进行Western blot检测,结果可见分子量分别为37 ku、63 ku和68 ku左右的重组基质膜蛋白(r M)、融合蛋白(r F)和血凝素蛋白(r H)条带,表明各重组杆状病毒构建成功,基质蛋白M、囊膜糖蛋白F和H在杆状病毒-昆虫细胞系统中获得了成功表达。综上所述,本研究利用杆状病毒-昆虫细胞系统成功表达了CDV M、F和H蛋白,并能与制备的鼠多克隆抗体及兔多克隆抗体发生特异性反应,均具有良好的反应原性,这为后期利用重组杆状病毒包装犬瘟热病毒VLPs,开发安全、有效的CDV VLPs疫苗的研制奠定了基础。
[Abstract]:In recent years , virus - like particles ( VLPs ) have been used as one of the hot spots and the future development trend of virus vaccine . The expression of M , F , H protein in insect cells and the preparation of polyclonal antibody are discussed . The results show that the recombinant plasmid pET - 30a ( + ) - M , pET - 30a ( + ) - F and p - ET - 30a ( + ) - H are respectively cloned into prokaryotic expression vector pET - 30a ( + ) . The recombinant plasmid pET - 30a ( + ) - M , p - ET - 30a ( + ) - F and p - ET - 30a ( + ) - H are respectively induced to express the recombinant proteins with molecular mass of 43 ku , 40 ku and 46 ku . The results of Western blot analysis showed that M , F and H recombinant proteins were specifically identified by anti - CDV polyclonal antibody in dogs . It has good reactivity , which lays a foundation for the development of safe and effective CDV VLPs vaccine .

【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.655

【参考文献】